李 爽，陸 雪，封江彬，田 梅，蔡恬靜，劉青杰*

(中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所，輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室，北京 100088)

隨著核能的開發(fā)與電離輻射的廣泛應用，核事故和輻射事故時有發(fā)生，在這種情況下，很有可能發(fā)生大規(guī)模人群受照的突發(fā)事故，快速、準確的確定具體的受照射劑量將對急性輻射損傷傷員的分類、診斷和治療具有至關重要的作用[1-3]。由于突發(fā)放射性事故中通過直接或間接物理劑量監(jiān)測裝置無法及時、有效地提供受照情況記錄，直接影響輻射損傷人員的醫(yī)學分類和救治。因此，需要建立快速、高通量的生物劑量估算方法。廣泛用于輻射生物劑量估算的染色體畸變分析因試驗周期長、技術要求高等缺點，無法滿足快速、高通量的要求。近年來，將輻射誘導基因的表達改變作為潛在的生物劑量計，因其可通過實時熒光定量PCR等技術實現(xiàn)快速和高通量檢測成為研究的熱點。

目前，在現(xiàn)有對輻射應答基因研究中，因研究對象、分析時間和所用芯片來源不同，所涉及輻射誘導差異表達的基因也有所不同[4-5]。雖然國內(nèi)外很多研究已經(jīng)確定了輻射強度與一些基因mRNA表達水平的劑量-效應關系，但由于這種現(xiàn)象并不是在所有細胞類型、劑量范圍和照射后的不同時間點都出現(xiàn)，因此，應用單基因的劑量-效應曲線估算受照劑量的準確度較差[6]。本研究在前期應用文獻計量學和系統(tǒng)生物信息學方法篩選和鑒定輻射敏感基因的基礎上[7-9]，進一步明確性別和年齡對離體人外周血中輻射敏感基因(CDKN1A、BAX、MDM2、XPC、PCNA、FDXR、GDF-15、DDB2、TNFRSF10B、PHPT1、ASTN2、RPS27L、BBC3、TNFSF4、POLH、CCNG1、PPM1D和GADD45A)mRNA表達水平變化的影響，為建立用于快速、準確估算輻射生物劑量的基因組合表達模型奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

肝素鋰抗凝真空采血管購于美國BD公司，RNAprep Pure血液總RNA提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo Fisher公司，NuHiTMRobostic SYBR Green購于蘇州新海生物科技股份有限公司，Taq聚合酶，DEPC水購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司，7500 Fast實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，NanoDrop 2000紫外分光光度儀購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 研究對象選擇非放射工作人員，近期無急性感染史，無高血壓和糖尿病等慢性疾病史，無吸煙史，無化學毒物接觸史以及近半年內(nèi)無射線接觸史的30名健康志愿者。男女各15人，年齡20～60歲，平均年齡為(39.03±12.58)歲，男女年齡差異無統(tǒng)計學意義，其中20～29歲8人，30～39歲8人，40～49歲8人，50～60歲6人。每名志愿者采集靜脈血12 mL，平均分裝至8個4 mL肝素鋰抗凝真空采血管內(nèi)備用。本研究經(jīng)中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所醫(yī)學倫理委員會審核批準(倫理審查號LLSC2016-014)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2.2 照射條件和細胞培養(yǎng)將已分裝的血樣在北京師范大學于室溫下進行60Co γ射線照射。源靶距為73.5 cm，平均照射野為30 cm×30 cm。劑量率為1 Gy/min，劑量分別0、0.5、1、2、3、4、6和8 Gy(0 Gy為陰性對照組)。照射完畢后，將每個劑量的血樣接種于含有8 mL 10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中(每瓶約含1.5 mL全血)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.2.3 細胞總RNA提取與cDNA合成收集細胞，按照RNAprep Pure血液總RNA提取試劑盒產(chǎn)品說明書提取總RNA，然后通過NanoDrop 2000紫外分光光度儀測定純度[D(260)/D(280)為1.8～2.0]并定量。然后應用高容量反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，取100～200 ng RNA，加入20 μL的反應體系中，經(jīng)25℃、10 min，37℃、120 min，85℃、5 min后終止反應，-20℃冰箱保存。

1.2.4 實時定量PCR引物合成根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫的基因信息，采用Primer Premier 5.0軟件設計用于實時定量PCR的18個輻射敏感基因(CDKN1A、BAX、 MDM2、XPC、PCNA、FDXR、GDF-15、DDB2、TNFRSF10B、 PHPT1、 ASTN2、 RPS27L、 BBC3、TNFSF4、POLH、CCNG1、PPM1D和GADD45A)以及內(nèi)參基因β-actin和B2M的引物序列。引物由上海生工生物技術有限公司合成，序列見表1。

1.2.5實時定量PCR檢測 反應體系為20 μL：10 μL 2×SYBR green I，2 μL cDNA模板，上下游引物共0.5 μL和7.5 μL雙蒸水。反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，72℃、45 s，40個循環(huán)，72℃、10 min。每個樣品設置3個平行樣，在每次實時定量PCR反應后進行熔解曲線分析，以排除引物二聚體的影響，同時設立無引物空白對照組，重復3次實驗，

1.2.6 數(shù)據(jù)處理利用Applied Biosystems 7500 Sequence Detection Software(SDS)進行結(jié)果分析。用法，以β-actin和B2M為內(nèi)參基因，相對定量18個輻射敏感基因在各照射劑量的mRNA表達水平變化 。 其 中 ， 內(nèi) 參 基 因 CT值

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學分析

基因mRNA相對表達水平以 xˉ±s表示，采用GraphPad Prism 5.00軟件對各個基因的劑量-效應關系進行一元線性回歸分析并作圖，以α=0.05為檢驗水準。采用SPSS 25.0軟件進行組間比較，各照射劑量組與對照組、男性組和女性組、以及4個年齡組間(20～29歲、30～39歲、40～49歲和50～60歲)的輻射敏感基因mRNA表達水平變化的差異，經(jīng)方差齊性檢驗，采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 60Co γ射線誘導離體人外周血18個輻射敏感基因mRNA表達水平的變化

0.5 ～8 Gy60Co γ射線照射30名正常人離體外周血，熒光定量PCR分析照射后12 h輻射敏感基因的mRNA表達水平變化。結(jié)果見圖1，可見與未受照組(0 Gy)相比，18個輻射敏感基因(CDKN1A、BAX、MDM2、 XPC、 PCNA、 FDXR、 GDF-15、 DDB2、TNFRSF10B、 PHPT1、 ASTN2、 RPS27L、 BBC3、TNFSF4、POLH、CCNG1、PPM1D和GADD45A)的mRNA在照后各劑量的相對表達水平均明顯增加，并且呈劑量-效應關系(R2=0.63～0.97，P＜0.05)。

輻射敏感基因的mRNA表達水平變化在不同個體間具有一定的差異性。在相同照射劑量，不同個體間MDM2、 XPC、 FDXR、 DDB2、 ASTN2 和 TNFSF4 mRNA相對表達水平最大可相差5倍以上(見圖2)，特別是FDXR和TNFSF4兩個基因雖然對電離輻射反應較為敏感并且具有較好的劑量-效應關系，但在不同個體間，兩基因的mRNA相對表達水平可相差十幾倍至幾十倍(圖2C、F)。其他基因的mRNA表達水平在不同個體間的差異約為2～4倍。

2.2 性別對輻射敏感基因mRNA表達水平變化的影響

分析性別對輻射誘導的基因mRNA表達變化的影響。結(jié)果顯示，男性和女性外周血中大多數(shù)基因在受到電離輻射作用后的mRNA相對表達水平之間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。但不同劑量60Co γ射線誘導的BAX、 TNFRSF10B、 ASTN2、 TNFSF4、 POLH 和GADD45A mRNA表達水平變化均高于男性(P＜0.05或P＜0.01)(見圖 3)。其中，在 0.5～8 Gy劑量范圍內(nèi)，ASTN2和TNFSF4兩個基因在女性外周血的mRNA相對表達水平均明顯高于男性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)(圖3C、D)。

2.3 年齡對輻射敏感基因mRNA表達水平變化的影響

通過對四個年齡組間各輻射敏感基因mRNA表達水平變化的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3～8 Gy劑量范圍內(nèi)，30～39歲年齡組MDM2 mRNA相對表達水平明顯高于其他 3 個年齡組(P＜0.05 或 P＜0.01)(圖 4A)；1～8 Gy60Co γ射線誘導的FDXR mRNA相對表達水平與年齡呈負相關，即隨著年齡的增長，該基因的mRNA相對表達水平逐漸下降，其中20～29歲和30～39歲分別與40～49歲和50～60歲年齡組之間具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或P＜0.01)(圖4B)；此外，離體人外周血在受到0.5～8 Gy照射后，DDB2 mRNA在20～29歲和30～39歲兩個年齡組的相對表達水平高于40～49歲和50～60歲年齡組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)(圖4C)； 照 射 2 Gy 和 6～8 Gy 后 ， 20～29 歲 年 齡 組RPS27L mRNA相對表達水平明顯高于30～39歲和40～49歲年齡組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)(圖4D)。輻射誘導的其他基因的mRNA表達水平變化在4個年齡組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖1 60Co γ射線照射離體人外周血輻射敏感基因mRNA表達水平的變化

3 討論

在大范圍核與輻射恐怖襲擊事件中，快速、有效、準確的生物劑量估算對傷員的分類診斷與醫(yī)學救治是至關重要的。與非穩(wěn)定性染色體畸變分析相比，通過應用先進的實驗技術平臺可以在短時間內(nèi)對輻射誘導的基因表達變化進行快速、高通量的檢測與分析，非常適合于大規(guī)模人群受到電離輻射作用后的劑量估算[11-13]。本研究在前期實驗的基礎上，進一步應用60Co γ射線照射離體人外周血，實時定量PCR方法定量分析18個輻射敏感基因的mRNA表達水平改變，同時分析基因表達的個體差異性，以及性別和年齡因素對基因表達的影響。

圖2 60Co γ射線照射離體人外周血輻射敏感基因mRNA表達水平變化的個體間差異

圖4 60Co γ射線照射后不同年齡組間輻射敏感基因mRNA表達變化

本研究對30名正常人離體外周血給予0～8 Gy60Co γ射線照射，發(fā)現(xiàn)人外周血中的18個輻射敏感基因的mRNA表達水平在照后12 h均隨受照劑量的增加而增加，劑量-效應關系呈現(xiàn)良好的線性依賴性，這與之前已報道的研究結(jié)果基本一致，提示這些基因滿足成為輻射生物劑量計的基本條件[14]。放射生物劑量學中，個體對電離輻射反應的差異性是影響準確估算生物劑量的關鍵因素[15]。本研究對30名正常人外周血在受到不同劑量照射后各基因mRNA表達水平變化的個體間差異進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在相同劑量，不同個體之間的基因mRNA相對表達水平均存在一定的變動性；特別是TNFSF4和FDXR兩個基因的mRNA相對表達水平在不同個體間的差異最大，在特定劑量可高達10倍或幾十倍，這一結(jié)果與之前報道的實驗結(jié)果基本相一致。如Manning等應用0.5～4 Gy X射線照射離體人外周血，結(jié)果表明輻射誘導的FDXR、DDB2和CDKN1A mRNA表達水平變化在相同劑量、不同受照個體之間均具有高于5倍的個體差異性[14]。研究表明，人外周血中基因表達水平廣泛地存在差異性，這種差異可以通過遺傳連鎖方式進行定位[16]。Correa等用淋巴細胞株探索輻射誘導的基因表達改變的個體差異性，發(fā)現(xiàn)FDXR和CDKN1A mRNA表達水平在同卵雙生雙胞胎中也存在較大的差異性[17]。在另一項研究中，應用體外照射人外周血白細胞發(fā)現(xiàn)的輻射敏感基因CDKN1A、GADD45A和DDB2，在全身照射的腫瘤患者中進行驗證，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)與體外實驗表現(xiàn)出相似的輻射效應，但在不同患者中，所有基因都表現(xiàn)出了不同程度的個體差異性[18-20]，提示輻射誘導基因表達的個體差異性反應了不同個體對于輻射損傷反應的敏感性，這為輻射遠期效應和風險評估提供了依據(jù)。

研究表明，基因表達的個體差異性主要與性別、年齡、吸煙、生活方式以及炎癥反應等因素相關[6，21]。本研究主要對性別和年齡兩個主要因素對輻射誘導基因表達變化的影響進行了分析。本研究結(jié)果表明離體照射的女性外周血中大多數(shù)基因的mRNA相對表達水平要高于男性，表明女性的輻射敏感性要高于男性。其中TNFSF4基因已被很多研究證明具有較強的輻射響應[4]，本研究發(fā)現(xiàn)輻射誘導TNFSF4 mRNA表達水平的變化是受性別因素所影響的，0～8 Gy60Co γ射線照后12 h，該基因的mRNA相對表達水平隨受照劑量的增加而增加，特別是在女性人群中各劑量的表達水平明顯高于男性人群，具有統(tǒng)計學差異。此外，GADD45A mRNA在受到較大劑量(＞3 Gy)照射后不同性別人群的相對表達水平存在差異。Tavakoli等應用0.5～4 Gy相同射線照射6名正常人外周血，同樣發(fā)現(xiàn)＞2 Gy劑量照射后女性外周血樣本中GADD45A mRNA表達水平明顯高于男性，具有統(tǒng)計學差異，與本實驗得到的結(jié)果相一致[19]。有研究應用小鼠全身照射模型，發(fā)現(xiàn)電離輻射誘導的DNA損傷、DNA甲基化、細胞增殖和凋亡等生物過程具有較明顯的性別特異性，這主要與性激素，特別是雌激素的分泌水平密切相關[22-23]。上述研究結(jié)果表明利用輻射敏感基因進行劑量估算時，應該充分考慮性別因素對其準確性的影響。在年齡因素方面，本研究發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)基因的mRNA表達水平存在年齡組間差異，其中FDXR基因表達是受年齡影響最大的基因。國外很多研究小組對輻射誘導FDXR基因表達的劑量-效應關系進行了研究，被認為是人外周血中比較穩(wěn)定的輻射生物劑量標志物。有研究表明，應用體外照射人外周血FDXR基因的劑量-效應曲線可以較準確估算≤2 Gy的受照劑量[6，24-26]。目前，國內(nèi)對該基因的研究較少，本研究結(jié)果證實FDXR mRNA在受到電離輻射誘導后，照后各時間點均呈現(xiàn)較好的劑量-效應關系，但1～6 Gy射線照后12 h，該基因mRNA相對表達水平呈現(xiàn)隨年齡增長而逐漸下降的趨勢，其中20～29歲和30～39歲之間無明顯統(tǒng)計學差異，但兩年齡組分別與40～49歲和50歲以上年齡組之間具有統(tǒng)計學差異，說明輻射誘導FDXR mRNA表達水平受年齡因素影響。Kajimura等對229名日本原爆人群進行雙著絲粒細胞數(shù)以及相關基因mRNA表達水平的聚類分析時發(fā)現(xiàn)，二者均呈現(xiàn)隨年齡增加而減少的趨勢[27]，提示受照者的年齡可能影響輻射誘導的基因表達水平變化，其分子機制還有待進一步研究。

本研究對輻射誘導的人外周血中輻射敏感基因mRNA表達水平變化的相關影響因素進行了初步分析，提示輻射敏感基因mRNA表達變化存在一定的個體間差異，這可能與受照者的性別和年齡有關，提示應用單一輻射敏感基因?qū)κ苷丈鋭┝窟M行估算時具有很大的不確定性。因此，下一步將建立用于估算生物劑量的基因組合表達模型，以盡可能消除相關因素的影響，進而提高輻射生物劑量估算的準確度。