胡志和，王麗娟，薛 璐，劉 平，賈 瑩，魯丁強(qiáng)

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

食物過(guò)敏反應(yīng)是人體對(duì)食物中抗原產(chǎn)生的超敏反應(yīng)，特別在發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)食物過(guò)敏的患病率越來(lái)越高[1]，嚴(yán)重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量，尤其對(duì)兒童的影響甚至比慢性兒童疾病更為嚴(yán)重[2]。蝦類雖然味道鮮美，卻是引起食物過(guò)敏的一類重要過(guò)敏原[3]。在食物過(guò)敏人群中，約有20%的過(guò)敏患者對(duì)蝦過(guò)敏，在兒童過(guò)敏患者中發(fā)病率高達(dá)60%[4]。研究發(fā)現(xiàn)，蝦類的過(guò)敏原蛋白主要包括原肌球蛋白（tropomyosin，TM）、精氨酸激酶、肌球蛋白輕鏈以及肌漿鈣結(jié)合蛋白，致敏率分別為80%、51%、57%和45%[5]。蝦類過(guò)敏原的研究主要集中在TM。自Shanti等[6]確定印度對(duì)蝦以及Daul等[7]確定褐對(duì)蝦（Penaeus aztecus）的主要過(guò)敏原是TM以來(lái)，研究者先后研究了刀額新對(duì)蝦[8]、龍蝦[9]、磷蝦[10-11]、凡納濱對(duì)蝦[12]、中國(guó)對(duì)蝦[13]、蝦蛄[11]及其他蝦蟹等甲殼類[14]水產(chǎn)品的TM，這些甲殼類水產(chǎn)品TM的一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量及抗原性質(zhì)（構(gòu)象表位和線性表位）等具有高度一致性。

近年來(lái)，研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到如何消減其致敏性方面。致敏性消減主要采用物理法、化學(xué)法和生物法，由于原料和產(chǎn)品的要求不同，所采用的方法也不同。在物理法中，主要有加熱、輻照、超聲波、超高壓及熱與超高壓結(jié)合等方法。Yu Huilin等[15]采用煮沸加熱、超聲波與煮沸加熱、高壓蒸汽加熱等方法處理TM，發(fā)現(xiàn)高壓蒸汽加熱能夠較好地促進(jìn)過(guò)敏原的消減；Li Zhenxing等[16]采用輻照方法處理蝦的提取蛋白，發(fā)現(xiàn)當(dāng)輻照劑量大于10 kGy時(shí)，蝦過(guò)敏原蛋白的致敏性才有顯著下降；Zhang Ziye等[17]采用高強(qiáng)度超聲波處理白蝦（Exopalaemon modestus）的TM，能夠使半胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）和賴氨酸（Lys）發(fā)生氧化，TM發(fā)生降解，導(dǎo)致α-螺旋含量降低，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲含量增加，進(jìn)而促進(jìn)TM的有效水解和致敏性的降低；胡志和等[18]采用超高壓處理凡納濱對(duì)蝦的TM，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)母邏禾幚砟軌蛳麥pTM的致敏性，且致敏性與TM的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)；Long Fangyu等[19]采用超高壓結(jié)合熱加工的方法處理凡納濱對(duì)蝦的TM，在55 ℃、500 MPa下處理10 min，TM與免疫球蛋白E（immune globulin E，IgE）的結(jié)合能力降低了73.59%?；瘜W(xué)法消減TM致敏性常采用的方法有酸水解法、美拉德反應(yīng)和小分子絡(luò)合反應(yīng)等。Fu Linglin等[20]將核糖、低聚半乳糖和低聚殼聚糖分別與TM進(jìn)行美拉德反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物的致敏性降低了60%，且α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)化；Lü Liangtao等[21]采用2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）與蝦的TM作用，發(fā)現(xiàn)AAPH能夠通過(guò)TM的聚集誘發(fā)其結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而降低TM的致敏性；另外，其還將4-羥基-2-壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal，HNE）與蝦的TM進(jìn)行作用，當(dāng)HNE濃度大于0.5 mmol/L時(shí)，TM與IgE的結(jié)合能力顯著下降[22]。Ahmed等[23]將酪氨酸酶與咖啡酸共同作用于蝦的TM，發(fā)現(xiàn)咖啡酸能夠促進(jìn)酪氨酸酶與TM的交聯(lián)，改變TM的空間結(jié)構(gòu)，降低其致敏性。生物法消減TM致敏性，主要采用的方法有酶法、微生物法、酶與高壓結(jié)合法。吳海明等[24-25]采用胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶分別水解蝦TM粗提物和蝦肉，發(fā)現(xiàn)這3 種酶對(duì)蝦蛋白的致敏性均有較好的消減作用；謝丹丹[26-27]和賈瑩[28]等采用酶與超高壓結(jié)合處理蝦TM粗提物、蝦肉和蝦仁，發(fā)現(xiàn)高壓下酶水解TM與常壓下酶水解TM相比，前者對(duì)TM致敏性消減效果更好；李鴻雁等[29]采用乳酸菌發(fā)酵蝦肉有效降低了TM的致敏性。

雖然有學(xué)者采用不同手段處理TM消減其致敏性，對(duì)TM的線性表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)[30-31]，但鮮有從線性表位殘留的角度分析酶水解效果與致敏性殘留的關(guān)系。本研究采用超高壓結(jié)合胰蛋白酶法處理凡納濱對(duì)蝦的TM，通過(guò)比較常壓下酶水解與超高壓下酶水解產(chǎn)物的致敏性差異及線性表位的殘留，分析水解產(chǎn)物致敏性消減的效果，為超高壓結(jié)合酶消減過(guò)敏原致敏性提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對(duì)蝦的TM（純度為97.65%） 天津商業(yè)大學(xué)食品專業(yè)實(shí)驗(yàn)室制備；胰蛋白酶、苯胺基萘磺酸（8-anilino-1-naphthalene-sulfonate，ANS）、兔抗南美白對(duì)蝦TM-IgG抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體 美國(guó)Sigma公司；其他實(shí)驗(yàn)試劑（均為分析純）天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；F-4600熒光分光光度計(jì) 日本日立高新技術(shù)公司；HPP.L2-1000/1型超高壓設(shè)備超高壓實(shí)驗(yàn)機(jī) 天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；DC-2030節(jié)能型智能恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；SpectraMax190光吸收酶標(biāo)儀 美國(guó)美谷分子儀器有限公司；FDU-810型冷凍干燥機(jī) 日本東京理化公司；Triple TOF 5600質(zhì)譜儀 美國(guó)SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 超高壓處理胰蛋白酶最適條件的確定

用磷酸鹽緩沖溶液（pH 8.0）將胰蛋白酶配制成0.1 mg/mL酶液，取5 mL酶液真空密封于聚乙烯密封袋，采用不同壓力處理30 min，確定使酶活力最高的壓力；在所確定壓力下保壓不同時(shí)間（0、10、20、30、40、50 min），確定適宜的保壓時(shí)間。采用福林-酚法測(cè)定胰蛋白酶活力[32]。

1.3.2 常壓下胰蛋白酶水解TM最適條件的確定

用磷酸鹽緩沖溶液（pH 8.0）將TM配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的溶液，在40 ℃、不同酶添加量（以TM溶液質(zhì)量計(jì)）（0（對(duì)照）、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500 U/g）下，水解30 min，水解物經(jīng)冷凍干燥后，采用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法[18]檢測(cè)水解產(chǎn)物的致敏性，以O(shè)D492nm表征致敏性，致敏性消減率按照下式計(jì)算，以確定適宜消減TM致敏性的酶解條件。

1.3.3 超高壓處理TM及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.3.1 超高壓處理TM

將TM用超純水溶解，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，真空密封包裝。選取不同的壓力（0.1（對(duì)照組）、100～900 MPa），在40 ℃下處理30 min，取出后冷凍干燥，對(duì)其進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.3.2 TM傅里葉變換紅外光譜掃描

稱取2 mg經(jīng)冷凍干燥的TM與100 mg KBr充分混合研磨，壓片后，采用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。采用EZ OMNIC軟件分析TM二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.3.3 TM熒光光譜掃描

將冷凍干燥的TM用磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）配制成0.1 mg/mL的溶液，取4 mL TM溶液，加入20 μL的ANS外源熒光探針溶液（5.0 mmol/L）。常溫下避光反應(yīng)1 h后，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，在320～380 nm范圍內(nèi)進(jìn)行熒光光譜掃描。

1.3.3.4 TM的致敏性

根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法檢測(cè)超高壓處理后TM的致敏性。

1.3.4 超高壓結(jié)合酶水解TM及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.4.1 常壓下酶水解超高壓處理的TM

將不同超高壓條件下（0.1、100～900 MPa）處理的TM用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液溶解成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的溶液，在1.3.2節(jié)所確定的最佳水解條件下進(jìn)行水解，采用間接ELISA法檢測(cè)水解產(chǎn)物的致敏性。

1.3.4.2 超高壓結(jié)合胰蛋白酶水解TM

采用1.3.1節(jié)所確定的有利于提高酶活力的條件，結(jié)合1.3.2節(jié)所確定的水解條件，對(duì)TM在超高壓下進(jìn)行水解，并檢測(cè)其致敏性變化。具體方法為，將TM用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的溶液，加胰蛋白酶3 000 U/g，在200 MPa、溫度40 ℃下水解時(shí)間30 min，檢測(cè)其致敏性變化。

1.3.5 常壓下水解產(chǎn)物與超高壓下酶法水解產(chǎn)物線性抗原表位殘留測(cè)定

此部分委托深圳華大基因公司進(jìn)行檢測(cè)。將TM在常壓下和超高壓（200 MPa）下水解（40 ℃、加酶量3 000 U/g、30 min）的產(chǎn)物，采用Triple TOF 5600質(zhì)譜儀進(jìn)行片段的氨基酸序列檢測(cè)，所用主要軟件為Maxquant v1.5.2.8。標(biāo)準(zhǔn)生物信息分析使用數(shù)據(jù)庫(kù)：CBI（add_target_Litopenaeus_vannamei_nr.fasta，709 sequences）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Litopenaeus＋vannamei）；搜索鑒定采用Maxquant軟件，在分析過(guò)程中，用于非特異性搜索的肽段長(zhǎng)度最小為8 個(gè)氨基酸殘基，最大為40 個(gè)氨基酸殘基。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)分析各組之間差異的顯著性，P＜0.05表明有顯著性差異。圖表制作利用Origin 8.6和Excel 2007軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對(duì)胰蛋白酶活力的影響

圖 1 超高壓處理對(duì)胰蛋白酶活力的影響Fig. 1 Effect of ultra-high pressure treatment on trypsin activity

由圖1A可知，在實(shí)驗(yàn)條件壓力范圍內(nèi)，處理胰蛋白酶30 min，其活力隨壓力的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)壓力在0.1～200 MPa范圍內(nèi)，隨壓力升高，胰蛋白酶活力上升，在200 MPa時(shí)胰蛋白酶的活力達(dá)到最大值，為223 U/mg，比對(duì)照0.1 MPa組提高39.38%；當(dāng)壓力在200～800 MPa范圍內(nèi)，隨壓力升高胰蛋白酶活力下降，800 MPa時(shí)，胰蛋白酶的活力為137 U/mg，比對(duì)照組降低14.38%；但在壓力小于400 MPa的范圍內(nèi)，胰蛋白酶的活力均高于對(duì)照組。

在200 MPa處理0～50 min，胰蛋白酶活力變化如圖1B所示。在保壓時(shí)間0～30 min范圍內(nèi)，胰蛋白酶活力上升，當(dāng)保壓時(shí)間為30 min時(shí)，胰蛋白酶活力達(dá)到最大值；在保壓時(shí)間40～50 min內(nèi)，胰蛋白酶活力開(kāi)始下降，當(dāng)保壓時(shí)間為50 min時(shí)，胰蛋白酶活力為152 U/mg，比對(duì)照組降低5%；但在保壓時(shí)間小于40 min的范圍內(nèi)，胰蛋白酶的活力均高于對(duì)照組。

綜上，在實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，能夠較好提高胰蛋白酶活力的條件為：溫度40 ℃、壓力200 MPa、保壓時(shí)間30 min。該結(jié)果與賈瑩[28]和劉平[33]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。酶活力在超高壓下隨壓力的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)的變化與其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的峰面積之比、酪氨酸及色氨酸等疏水氨基酸殘基暴露程度有關(guān)[34]。超高壓改變胰蛋白酶酶活性中心的非共價(jià)鍵，使活性中心部分暴露，從而使酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而改變酶活力[33,35]。

2.2 常壓條件水解對(duì)TM產(chǎn)物致敏性的影響

圖 2 常壓條件下酶添加量對(duì)TM產(chǎn)物致敏性消減率的影響Fig. 2 Effect of trypsin-to-TM ratio on allergenicity reduction of TM

在胰蛋白酶水解TM過(guò)程中，酶與底物比例不同，其水解效率不同，且水解產(chǎn)物片段的大小也存在差異，導(dǎo)致水解產(chǎn)物的致敏性不同[26]。由圖2可知，隨著酶添加量（0～3 500 U/g）的增加，水解產(chǎn)物的致敏性（OD492nm）逐漸降低，致敏性消減率逐漸提高。在酶的添加量不小于3 000 U/g時(shí)，TM水解產(chǎn)物的致敏性消減率為89%。

2.3 超高壓處理對(duì)南美白對(duì)蝦TM結(jié)構(gòu)及其免疫原性關(guān)系的影響

2.3.1 超高壓處理引發(fā)TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

圖 3 不同壓力處理后TM的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of TM treated at different pressures

圖3為經(jīng)不同壓力處理后的TM傅里葉變換紅外光譜圖；經(jīng)OMNIC軟件分析，TM二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量變化見(jiàn)圖4，TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，該結(jié)果與Lyon等[36]采用自優(yōu)化預(yù)測(cè)法預(yù)測(cè)的TM二級(jí)結(jié)構(gòu)含量基本一致，但與圓二色光譜法檢測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量[18]存在差異。

圖 4 不同壓力處理TM二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Fig. 4 Changes in secondary structures of TM treaded at different pressures

由圖4可知，在100～600 MPa范圍內(nèi)，隨處理壓力升高，TM的α-螺旋相對(duì)含量增大，600 MPa時(shí)達(dá)到最大（94.8%），隨后降低，但變化不大。在100～600 MPa范圍內(nèi)，隨壓力增大，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；500、600 MPa處理組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)壓力大于600 MPa后，其相對(duì)含量出現(xiàn)上升。對(duì)于無(wú)規(guī)卷曲，100～900 MPa范圍內(nèi)，隨壓力的增大，其相對(duì)含量變化無(wú)規(guī)律性，但600～700 MPa范圍內(nèi)與對(duì)照組（0.1 MPa）相比差異顯著（P＜0.05）。隨壓力的增大，β-折疊相對(duì)含量變化無(wú)規(guī)律性。該檢測(cè)結(jié)果與圓二色光譜法檢測(cè)的結(jié)果[19]存在差異性，可能與檢測(cè)方法不同有關(guān)。

2.3.2 熒光光譜檢測(cè)超高壓處理后TM的氨基酸微環(huán)境（三級(jí)結(jié)構(gòu)）變化

由圖5、表1可知，在40 ℃不同壓力（0.1、100～900 MPa）下處理30 min，TM的最大發(fā)射波長(zhǎng)的紅移和藍(lán)移變化不明顯；熒光強(qiáng)度呈一定規(guī)律性變化。在100～600 MPa范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨著壓力增加逐漸減小，當(dāng)壓力達(dá)到600 MPa時(shí)，熒光強(qiáng)度最低；700～900 MPa范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨壓力增加而升高。熒光強(qiáng)度的變化主要是在不同壓力條件下疏水性氨基酸的暴露或掩蔽程度不同造成的。由此可見(jiàn)，隨處理壓力的變化，TM氨基酸微環(huán)境（三級(jí)結(jié)構(gòu)）發(fā)生變化，導(dǎo)致空間構(gòu)象的變化。

圖 5 不同壓力處理后的TM熒光光譜圖Fig. 5 Fluorescence spectra of TM treated at different pressures

表 1 不同壓力下處理TM的發(fā)射波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度Table 1 Changes in emission wavelength and fluorescence intensity of TM treated at different pressures

2.3.3 不同壓力處理引發(fā)TM的致敏性變化

圖 6 不同壓力下處理對(duì)TM致敏性的影響Fig. 6 Effect of high hydrostatic pressure on allergenicity of TM

如圖6所示，在100～600 MPa范圍內(nèi)，隨著壓力的增加，致敏性不斷降低，600 MPa時(shí)致敏性降至最低（OD492nm＝0.075）。600～900 MPa范圍內(nèi)，隨著壓力增大，OD492nm逐漸增加，但在900 MPa時(shí)，其致敏性仍然小于對(duì)照組。所以超高壓處理對(duì)TM的免疫原性有一定的消減作用。這是因?yàn)門M在經(jīng)過(guò)超高壓處理后，蛋白質(zhì)內(nèi)的非共價(jià)鍵發(fā)生變化，引起其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致生物活性變化，體現(xiàn)為致敏性的變化，由于處理溫度、時(shí)間和壓力的不同，其結(jié)果也存在差異[18]。Long Fangyu等[19]發(fā)現(xiàn)經(jīng)55 ℃、500 MPa處理10 min的蝦TM與沸水加熱組相比，其與IgE的結(jié)合能力降低了73.59%；雖然與本實(shí)驗(yàn)條件不同，但結(jié)果均能說(shuō)明超高壓能有效降低TM的致敏性。

2.3.4 TM結(jié)構(gòu)變化與致敏性的關(guān)系

TM在100～600 MPa超高壓處理?xiàng)l件下，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量的變化趨勢(shì)與TM致敏性變化趨勢(shì)有一定的相關(guān)性（圖7）；壓力超過(guò)500 MPa后，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。

圖 7 壓力引發(fā)TM二級(jí)結(jié)構(gòu)（β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量）變化與致敏性的關(guān)系Fig. 7 Relationship between changes in secondary structure (β-turn relative content) of TM caused by high pressure processing and its allergenicity

超高壓處理后TM的熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)與其致敏性變化具有很好的相關(guān)性（圖8），特別是在0.1～600 MPa范圍內(nèi)，變化趨勢(shì)一致；但當(dāng)壓力大于600 MPa，其致敏性低于對(duì)照組，而熒光強(qiáng)度卻高于對(duì)照組，這可能是由于超高壓處理TM的致敏性變化是由二級(jí)和三級(jí)變化共同引起，是一個(gè)綜合現(xiàn)象，具體原因還需要進(jìn)一步研究。

圖 8 不同壓力處理TM熒光強(qiáng)度變化與致敏性的關(guān)系Fig. 8 Relationship between fluorescence intensity of TM caused by high pressure processing and its allergenicity

2.4 超高壓結(jié)合酶法對(duì)南美白對(duì)蝦TM致敏性消減效果的影響

2.4.1 先超高壓再胰蛋白酶水解消減TM致敏性

先經(jīng)不同壓力處理，再經(jīng)胰蛋白酶水解（酶添加量3 000 U/g、40 ℃水解30 min）后，TM致敏性和致敏性消減率的結(jié)果如圖9所示，經(jīng)超高壓處理后，氨基酸微環(huán)境（三級(jí)結(jié)構(gòu)）的變化會(huì)導(dǎo)致水解位點(diǎn)的暴露或掩蔽，從而導(dǎo)致水解產(chǎn)物出現(xiàn)差異，進(jìn)而使得水解產(chǎn)物致敏性的不同。在100～600 MPa范圍內(nèi)，隨著壓力的增大，水解產(chǎn)物的致敏性逐漸降低，致敏性的消減率逐漸增強(qiáng)，在600～900 MPa范圍內(nèi)，隨壓力增加，水解產(chǎn)物的致敏性逐漸增大，致敏性消減率逐漸降低。

圖 9 先超高壓處理再胰蛋白酶水解對(duì)TM 致敏性消減率的影響Fig. 9 Effect of high pressure treatment followed by trypsin hydrolysis on allergenicity reduction of TM

與對(duì)照組（0.1 MPa處理組）相比，壓力在100～200 MPa范圍內(nèi)，水解產(chǎn)物致敏性相對(duì)增加，且100 MPa處理組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；壓力在300～600 MPa范圍內(nèi)，水解產(chǎn)物的致敏性小于對(duì)照組，且500～600 MPa下處理后水解產(chǎn)物的致敏性顯著低于對(duì)照組；當(dāng)壓力在700～900 MPa范圍內(nèi)，水解產(chǎn)物的致敏性又有所升高，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。從結(jié)果可知，在500～600 MPa范圍內(nèi)處理TM，再用胰蛋白酶水解，可以顯著降低水解產(chǎn)物致敏性（600 MPa處理后的水解物致敏性消減率為96%），其原因可能是由于在此壓力范圍內(nèi)處理后再用酶水解，更有利于TM線性表位的消除。

2.4.2 超高壓下胰蛋白酶水解TM

在有利于提高酶活力的超高壓條件（溫度40 ℃、壓力200 MPa、保壓時(shí)間30 min）下水解TM（TM質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、酶添加量3 000 U/g、壓力200 MPa、溫度40 ℃、水解時(shí)間30 min），檢測(cè)其致敏性變化。結(jié)果顯示，在該條件下TM水解產(chǎn)物的OD492nm為0.006±0.001，致敏性消減率為98%，較常壓下TM水解產(chǎn)物的致敏性消減率（89%）（圖2）提高了9%。

針對(duì)該差異的原因，對(duì)常壓下的水解產(chǎn)物和超高壓下的水解產(chǎn)物用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析（圖10），從泳道4和5的比較可以發(fā)現(xiàn)，在超高壓下酶水解TM效果更好，水解更加徹底。但由于TM水解后線性表位的分子質(zhì)量較小，在SDS-PAGE中無(wú)法體現(xiàn)，因此在兩種條件下的水解產(chǎn)物能夠引發(fā)致敏性的線性表位殘留情況還需要進(jìn)一步分析。

圖 10 超高壓下蝦蛋白水解物SDS-PAGE圖Fig. 10 SDS-PAGE analysis of TM hydrolysates under high pressure

2.5 常壓下酶水解產(chǎn)物與超高壓下酶水解產(chǎn)物線性抗原表位殘留

表 2 常壓下TM水解物中的肽段種類Table 2 Peptides in trypsin hydrolysates under the normal pressure

為了進(jìn)一步研究TM在常壓下水解產(chǎn)物和超高壓下水解產(chǎn)物在致敏性方面的差異，將2.3.2節(jié)中水解獲得的產(chǎn)物采用質(zhì)譜儀進(jìn)行片段檢測(cè)。如表2所示，常壓下TM水解產(chǎn)物中共有11 類233 個(gè)片段，片段長(zhǎng)度分布見(jiàn)圖11；超高壓下TM水解產(chǎn)物中共有11 類90 個(gè)片段（表3），片段長(zhǎng)度分布見(jiàn)圖12。

從線性抗原表位消除效果分析，目前公開(kāi)發(fā)表的資料顯示，國(guó)內(nèi)學(xué)者預(yù)測(cè)蝦的TM線性抗原表位有10 個(gè)[31]，國(guó)外學(xué)者預(yù)測(cè)的TM線性抗原表位有9 個(gè)[32]。常壓下TM水解產(chǎn)物片段種類（11 類、233 個(gè)片段）（表2）中，與國(guó)內(nèi)學(xué)者預(yù)測(cè)的線性抗原表位相比，殘留4 個(gè)線性抗原表位（表2中波浪線片段），線性抗原表位消減率為60.0%，在233 個(gè)水解片段中，含有線性抗原表位的片段共12 個(gè)（表2中括號(hào)外數(shù)值）；與國(guó)外學(xué)者預(yù)測(cè)線性抗原表位相比，殘留線性抗原表位3 個(gè)（表2中下劃線片段），消減率為66.7%，在233 個(gè)水解片段中，含有線性抗原表位的水解片段7 個(gè)（表2中括號(hào)內(nèi)數(shù)值）；參考國(guó)內(nèi)和國(guó)外學(xué)者預(yù)測(cè)的線性抗原表位，其線性抗原表位的消減率為60.0%～66.7%。

圖 11 常壓下TM水解物中的肽段長(zhǎng)度分布Fig. 11 Peptide length distribution in TM hydrolysate under normal pressure

表 3 超高壓下TM水解產(chǎn)物的肽段種類Table 3 Peptides in TM hydrolysate under high pressure

超高壓下TM水解產(chǎn)物片段種類（11 類、90 個(gè)片段）（表3），與國(guó)內(nèi)學(xué)者預(yù)測(cè)線性抗原表位相比，殘留1 個(gè)線性抗原表位（表3中波浪線片段），線性抗原表位消減率為90.0%，在90 個(gè)水解片段中，含有線性抗原表位的水解片段只有1 個(gè)；與國(guó)外學(xué)者預(yù)測(cè)的線性抗原表位相比，殘留1 個(gè)線性抗原表位（表3中下劃線片段），表位消減率為88.9%，在90 個(gè)水解片段中，含有線性抗原表位的水解片段只有3 個(gè)（表3中括號(hào)內(nèi)數(shù)值）；參考國(guó)內(nèi)和國(guó)外學(xué)者預(yù)測(cè)的線性抗原表位，其線性抗原表位消減率為88.9%～90.0%。因此，從線性抗原表位消減效果分析，超高壓下水解TM，更有利于其線性抗原表位的消除。

比較TM水解產(chǎn)物片段的氨基酸殘基數(shù)量，在常壓下TM水解產(chǎn)物的233 個(gè)片段中，含8～16 個(gè)氨基酸殘基的片段數(shù)量占76.8%，大于16 個(gè)氨基酸殘基的片段數(shù)量占23.2%（圖11）；在超高壓下TM水解產(chǎn)物的90 個(gè)片段中，含8～16 個(gè)氨基酸殘基的片段數(shù)量占93.3%，大于16 個(gè)氨基酸殘基的片段數(shù)量占6.7%（圖12）。因此，TM在超高壓下水解，產(chǎn)物的片段小，水解較徹底，更有利于線性抗原表位的消除。

圖 12 超高壓下TM水解物中的肽段長(zhǎng)度分布Fig. 12 Peptide length distribution in TM hydrolysate under high hydrostatic pressure

3 結(jié) 論

TM是蝦的主要過(guò)敏原，采用常壓下酶水解或超高壓處理，其致敏性消減效果相對(duì)較差。采用超高壓與酶水解相結(jié)合的方法，即超高壓下酶水解TM，在較低壓力、適宜溫度和酶與底物比下進(jìn)行處理，不僅可以提高酶活力，提高水解效率，而且水解徹底，更有利于線性表位的消除，進(jìn)而提高致敏性的消減效率。