周 森，趙衛(wèi)鵬，胡佳音，王 瑛，李艷敏，朱婷婷，魏金旺

（1.北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京 101301；2.北京農(nóng)學院生物科學與工程學院，農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206）

牛欄山二鍋頭屬于清香型白酒，是我國白酒三大香型之一。在牛欄山釀造過程中，酵母菌分別在糖化、產(chǎn)酒和生香方面起著重要作用。前期研究表明，二鍋頭釀造過程中酵母菌可分為扣囊覆膜酵母、釀酒酵母和生香酵母三大類，其中扣囊覆膜酵母能夠產(chǎn)生高活力的淀粉酶[1]，具有同時水解α-1,4和α-1,6-糖苷鍵的能力，常被認為是發(fā)酵前期的糖化菌；釀酒酵母能夠將發(fā)酵環(huán)境中的糖類物質在厭氧環(huán)境下轉化為乙醇，是牛欄山二鍋頭發(fā)酵的主要產(chǎn)酒菌；生香酵母則是一類能夠代謝酯類物質的酵母菌總稱[2]，能夠在生長、繁殖過程中產(chǎn)生芳香氣味物質[3]。

目前，人們發(fā)現(xiàn)白酒釀造過程中生香酵母對酸和醇具有不同程度的酯化能力，并且在代謝過程中能夠生成多種風味化合物，是酯類物質的主要來源[4]。在牛欄山二鍋頭釀造過程中，生香類酵母可分為扁平云假絲酵母（Candida humilis）、庫氏畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)、戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）、粉狀畢赤酵母（Pichia farinosa）及異常威克酵母(Wickerhamomyces anomalus)[5]，王勇等[6]利用高粱和酒醅作為培養(yǎng)基，分別測定了不同生香酵母代謝產(chǎn)物，確定出庫氏畢赤酵母(P.kudriavzevii)和異常威克酵母(W.anomalus)具有高產(chǎn)乙酸乙酯能力。乙酸乙酯是構成二鍋頭酒風味的主體酯類，常表現(xiàn)為水果香、花香和甜香，對二鍋頭酒香氣貢獻較大。因此本研究利用純培養(yǎng)技術制備庫氏畢赤酵母和異常威克酵母菌劑，按不同添加量加入地缸中進行固態(tài)發(fā)酵，根據(jù)基酒乙酸乙酯含量變化，評定不同生香酵母在二鍋頭釀造過程中的實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株：牛欄山酒廠菌種庫保藏庫氏畢赤酵母、異常威克酵母。

試劑：三氯甲烷、異丙醇、醋酸鉀、硫酸(均為分析純)，北京化工廠；乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)、0.5%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)，上海生工生物工程有限公司。

酵母富集培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基：yeastextract10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，水1 L。

酵母分離培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基：yeastextract10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L，115℃滅菌30 min，倒平板前加入20 mg/L氯霉素。

菌劑凍存劑：甘油120 mL，海藻糖30 g，脫脂牛奶60 g，水480 mL，115℃滅菌30 min[7]。

儀器設備：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司BSC-1100ⅡA2型生物安全柜；德國Eppendorf公司1-14k高速冷凍離心機；美國賽默飛世爾科技公司Multifuge X1R臺式冷凍離心機；寧波江南SPX-320型生化培養(yǎng)箱；7890B氣相色譜儀，美國安捷倫公司。C1000快速梯度基因擴增儀、Powerpac Basic基礎型水平電泳儀、GelDoc XR+BIO-RAD全自動凝膠成像儀，美國Bio Rad公司；Waters 2695高效液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌劑制備

利用YPD固體培養(yǎng)基活化庫氏畢赤酵母和異常威克酵母，接種環(huán)挑一環(huán)活化菌體于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中28℃，200 r/min培養(yǎng)48 h，吸取10 mL菌液加入到YPD液體培養(yǎng)基中（500 mL）放大培養(yǎng)，28℃，200 r/min搖床培養(yǎng)3 d后，8000 r/min離心菌液收集菌體沉淀。根據(jù)沉淀量加入菌劑凍存液[7]，混勻后-80℃攝氏度凍存。

1.2.2 菌種添加

按清香型白酒正常工藝進行發(fā)酵實驗，工藝操作流程如下：將破碎好的高粱（4瓣、6瓣、8瓣）用熱水浸潤24 h，裝甑清蒸90 min，蒸完后取出攤晾，加入大曲粉后拌勻，入缸發(fā)酵，待酒醅發(fā)酵成熟（28 d），添加適量輔料，拌勻，蒸酒。以正常釀造工藝作為對照組，添加菌劑作為實驗組，添加量如表1所示。

表1 實驗組菌體添加量

1.2.3 發(fā)酵菌群跟蹤

跟蹤發(fā)酵過程，取發(fā)酵5 d、10 d酒醅進行酵母分離，檢測強化菌在發(fā)酵中生長情況。

分離培養(yǎng)：稱取發(fā)酵5 d、10 d酒醅10 g于90 mL無菌水中混勻，擬定為10-1濃度，吸取1 mL于9 mL無菌水中，標記為10-2，依次稀釋為10-3、10-4、10-5、10-6梯度。吸取不同梯度液0.1 mL，分別涂布YPD平板中。根據(jù)菌落的生長情況,30℃培養(yǎng)24～48 h。

菌落計數(shù)：挑選菌落數(shù)在30～300的平板,根據(jù)酵母菌形態(tài)差異，分類別單獨計數(shù)，采用PCR在不同類別中隨機抽樣鑒定20～30株，確定該類別酵母準確分類，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計算不同酵母菌的種群數(shù)量[8-9]。

1.2.4 酵母PCR擴增及測序

挑取少量活化的菌體，于1.5 mL離心管內；加入100μL裂解液（100 mM Tris，30 mM EDTA，0.5%SDS，pH8.0，115℃滅菌30 min備用）；100℃水浴15 min；加入100μL 2.5 mol/L的醋酸鉀溶液，冰浴60 min；4℃下12000 r/min離心5 min，取上清液200μL至0.5 mL離心管中；加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），劇烈振蕩10 min，12000 r/min離心15 min，移取100μL上清液至0.5 mL離心管中；加入100μL預冷的異丙醇，混勻后-20℃下放置20 min；12000 r/min離心15 min，棄去上清液；用70%的酒精洗滌沉淀2次；沉淀過夜自然干燥；加入50μL已滅菌的超純水，室溫下溶解1 h，-20℃冰箱儲藏備用[10-11]。

表2 酵母PCR引物序列

對所提取的酵母菌DNA進行26SrDNA D1/D2區(qū)片段擴增，采用通用引物NL1/NL4，如表2所示。

PCR反應條件：94℃加熱3 min使模板DNA變性，然后進入下列溫度循環(huán)：94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，共進行35個循環(huán)，最后在72℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物送公司測序后，用Chromas軟件分析測序質量，去除峰圖不可靠的部分，對DNA序列進行手動校正，用校正后的序列在美國國家生物技術信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進行同源序列搜索，比較該菌株在D1/D2序列上親緣關系最近的已知酵母菌信息，可以根據(jù)序列同源性初步判斷待測菌株的分類地位。利用軟件MEGA5.10對所有序列進行比對后，刪除兩端未對齊的堿基生成進化樹，并進行1000次的Bootstrap method檢驗。采用鄰接(neighbor-joining,NJ)法顯示進化樹，判斷待測菌株的分類地位[12]。

1.2.5 酒醅產(chǎn)酸、產(chǎn)酒測定

樣品處理：取出池酒醅10 g，至50 mL離心管中，加入30 mL MiliQ水，顛倒混勻后常溫200 W超聲萃取40 min，吸取上清液2 mL，12000 r/min離心20 min，0.22μm濾膜過濾后利用液相色譜測定酒醅中酒精和乙酸、乳酸含量。

液相色譜條件：柱溫60℃，檢測器溫度50℃，流速0.6 mL/min，進樣量10μL。分離柱：Bio-Red HPX 87H 125-0140；保 護 柱Cation H Cartridge 125-0129；流動相：5 mM H2SO4。

1.2.6 基酒色譜成分檢測

發(fā)酵結束后，將所獲得基酒降至60%vol，利用氣相色譜對基酒揮發(fā)性物質進行骨架成分分析。

氣相色譜條件：CPwax57色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2μm)；進樣口溫度250℃；進樣量0.8μL；分流比=30∶1；控制方式流量；檢測器溫度280℃；柱流速1 mL/min；空氣流量300 mL/min；氫氣流量30 mL/min；尾吹氣流量25 mL/min；柱箱溫度：35℃保持3 min，以1℃/min升至50℃，再以20℃/min升至200℃，保持15 min。

2 結果與分析

2.1 酵母種屬生長情況

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)牛欄山二鍋頭釀造過程中產(chǎn)酯酵母主要集中在發(fā)酵前中期[13]。因此我們跟蹤發(fā)酵過程，采集發(fā)酵5 d和10 d樣品，對發(fā)酵過程不同類別酵母菌進行數(shù)量統(tǒng)計和種屬鑒定，判斷實驗組中所加生香酵母生長情況。鑒定和分離結果如圖1所示。

本研究采取不同類酵母菌隨機抽樣鑒定方式，鑒定酵母菌230株，共分為4個種，分別為扣囊覆膜酵母(S.fibuligera)、異常威克酵母(W.anomalus)、釀酒酵母(S.cerevisiae)和庫氏畢赤酵母(P.kudriavze-vii)。將鑒定結果與酵母數(shù)量相結合，確定不同發(fā)酵階段酵母菌數(shù)量關系，如圖2所示。

圖1 酵母菌基于26SrDNA的D1/D2序列構建的發(fā)育樹

圖2 發(fā)酵5 d、10 d酵母菌數(shù)量關系圖

由圖2可知，發(fā)酵5 d樣品均含有扣囊覆膜酵母和釀酒酵母：扣囊覆膜酵母數(shù)量在4.9～5.9 log（cfu/g）之間，與對照組數(shù)量差異在0.4～0.6 log（cfu/g）之間；實驗組釀酒酵母數(shù)量在7～7.4 log（cfu/g）之間，稍低于對照組，相差在0.1～0.4 log（cfu/g）。對照樣品中并未分離到生香酵母，PK樣品組中不同添加量中均能分離到庫氏畢赤酵母，分別為7.4 log（cfu/g）和7.1 log（cfu/g）；在WA樣品中，WA-1組并未分離到異常威克酵母，WA-2組中分離獲得5.7 log（cfu/g）異常威克酵母。在發(fā)酵10 d，5組樣品中酵母菌均為釀酒酵母，數(shù)量在7.5～7 log（cfu/g）。

通過上述數(shù)據(jù)可以確定，實驗組與對照組中扣囊覆膜酵母和釀酒酵母數(shù)量基本一致，說明發(fā)酵主體酵母菌群并未因為添加強化菌而發(fā)生改變。在實驗組中，除WA-1組外，其余實驗組在發(fā)酵5 d均能分離到所添加菌種，在10 d樣品中無法分離到，說明在二鍋頭釀造過程中，上述兩種生香酵母僅在發(fā)酵前期存活，而隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵環(huán)境發(fā)生變化，兩種生香酵母逐漸死亡。

2.2 酒醅產(chǎn)酸產(chǎn)酒測定

生香酵母不僅具有較強的產(chǎn)酯能力，同時還能夠生成多種有機酸類物質，有機酸是二鍋頭酒中重要的呈香物質和酯類合成前體，同時也在白酒風味調節(jié)中起重要作用[14]。王勇等[15]利用離子色譜檢測了二鍋頭酒中主要有機酸類物質，確定了乳酸和乙酸含量遠高于其他有機酸類，是二鍋頭酒中主要有機酸。因此本研究利用液相色譜，測定實驗出池酒醅乳酸、乙酸和乙醇含量，判斷兩種生香酵母對發(fā)酵產(chǎn)酸、產(chǎn)酒方面的影響。

圖3 出池酒醅酒精、乙酸、乳酸含量圖

由圖3可知，對照樣品酒精含量為33.18 g/L，實驗組酒精含量為25.67～30.71 g/L，均低于對照樣品，且隨著菌體添加量與酒精含量成反比；在乙酸生成量中，對照酒醅乙酸含量為0.44 g/L，PK組乙酸含量明顯高于對照組，與對照組相比分別提高了54.5%和47.7%，WA組乙酸含量稍高于對照組，提高量為11.4%和20.5%；在乳酸生成量中，實驗組與對照組乳酸含量相差不大。可以看出，在發(fā)酵過程中，庫氏畢赤酵母和異常威克酵母均降低了酒醅中酒精含量，同時提高了酒醅中乙酸含量。

2.3 基酒風味成分檢測

利用氣相色譜測定5組基酒揮發(fā)性成分，共檢測到33種化合物，其中酯類物質19種，醛類4種，醇類10種，見表3。

酯類是二鍋頭酒中重要呈香物質，大部分表現(xiàn)為水果香和花香。目前普遍認為，生香酵母具有較強的產(chǎn)酯能力，因此本次實驗基酒，重點關注乙酸乙酯含量變化情況。如表3所示，實驗組中乙酸乙酯含量均高于對照組，其中PK-1組和WA-2組產(chǎn)乙酯量最高，含量分別達到6492.68 mg/L和6148.80 mg/L，比對照組提高了28%和21.2%。乳酸乙酯同樣是二鍋頭酒中重要的酯類化合物，在5組產(chǎn)物中，乳酸乙酯含量基本持平，說明兩種酵母的添加并未影響乳酸乙酯的合成。

表3 基酒揮發(fā)性成分含量 (mg/L)

從添加量角度分析，PK樣品組中，PK-2添加量要高于PK-1，但較高的添加量并未使基酒中乙酸乙酯含量高于PK-1組；WA樣品組中，WA-2添加量高于WA-1，其乙酸乙酯含量高于WA-1。

除結果中乙酸乙酯、乳酸乙酯兩種含量較高的酯類物質，將其余17種含量較低的酯類物質，利用HemL 1.0.3.3處理后進行熱圖分析，獲得5組基酒樣品微量酯類變化圖，如圖4所示。

結合圖4和表3可以看出，在含量較低的酯類物質中，與對照組相比，實驗組中提高較為明顯的酯類物質為乙酸異戊酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯，剩余酯類物質含量差異并不明顯。說明兩種生香酵母除提升基酒乙酸乙酯外，同時也提升了部分基酒中脂肪酸酯。

除酯類物質外，基酒樣品中同樣檢測到14種醇和醛類化合物，利用HemL 1.0.3.3對數(shù)據(jù)處理后進行熱圖分析，獲得5組基酒樣品醇醛物質變化規(guī)律，如圖5所示。

圖5 基酒醇、醛含量分析圖

根據(jù)圖5和表3可以看出，在醇類物質中，實驗組中含量增長較高的醇類物質為雜醇油類，如正丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇，并且發(fā)現(xiàn)菌體添加量與這幾種雜醇油生成量成正比關系，說明添加庫氏畢赤酵母和異常威克酵母除了能夠提高乙酸乙酯外，還能夠提升基酒中雜醇油類物質。4種醛類物質中，乙醛和乙縮醛是含量較高的醛類，對照組與實驗組之間含量差異不大，基本維持穩(wěn)定。

3 結論

在工藝不變的前提下，利用群落總數(shù)的添加方法可以有效的控制菌群添加量，能夠更加方便快捷的確定最優(yōu)添加比例。同時利用傳統(tǒng)分離能夠發(fā)現(xiàn)，強化添加的庫氏畢赤酵母和異常威克酵母主要活躍在發(fā)酵前期，且并不影響其余酵母菌群的正常增長。在代謝產(chǎn)物方面，兩種酵母菌均降低出池酒醅酒精含量，且酒醅酒精含量與菌體添加量呈反比關系；出池酒醅中乙酸含量提升明顯，與對照組相比，最高提高了54.5%，達到0.68 g/L；基酒乙酸乙酯提升較為顯著，最高達到6492.68 mg/L，提升28%；對酒醅乳酸含量和基酒中乳酸乙酯影響不大；在醇類合成方面，實驗組基酒雜醇油類稍有提升，且與菌體添加量呈正比關系；其余組分影響不大。

通過4組實驗我們可以得出，兩種生香酵母在二鍋頭釀造過程中均能夠生成乙酸并降低酒醅中乙醇濃度，提高基酒乙酸乙酯含量，但同時也相應提高了基酒中雜醇油類物質。同時本次實驗初步確定添加7.5×1010cfu庫氏畢赤酵母和1.2×1011cfu異常威克酵母對提升基酒乙酸乙酯能力較為優(yōu)秀。下一步將根據(jù)上述實驗成果，調節(jié)不同群落總數(shù)添加方案，篩選出適合二鍋頭釀造的最優(yōu)添加比例進行中試生產(chǎn)，以達到提高基酒風味品質等目的。