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        黃酒發(fā)酵菌株篩選、鑒定及應(yīng)用

        2019-12-03 02:13:02溫承坤李小強(qiáng)方尚玲陳茂彬
        釀酒科技 2019年11期
        關(guān)鍵詞:態(tài)氮黃曲霉黃酒

        陳 孝,溫承坤,張 玉,李小強(qiáng),方尚玲,陳茂彬

        (湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)中心,湖北武漢 430068)

        黃酒作為一種發(fā)酵酒,氨基態(tài)氮(氨基酸)含量是其中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。氨基酸是組成生命的重要元素,是人體不可或缺的物質(zhì),同時(shí)在代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。人體有8種必需氨基酸不能合成,需要從外界食物中攝入。目前很多中小型廠家黃酒中氨基酸含量較低,不能夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)中的最低值。黃酒中氨基酸主要來源于原材料中蛋白質(zhì)的分解。本研究主要是為了增加黃酒發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)分解力,通過提高氨基酸含量來完善黃酒品質(zhì),提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑及儀器

        原料:酒曲,主要來源于麻城、房縣和孝感等酒廠;大米和小麥。

        試劑:Rnase、異丙醇、乙醇、SDS、無水乙醇、1X T(pH 8.0)、Folin試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、酪蛋白、酪氨酸溶液等。

        儀器設(shè)備:電子分析天平、搖床、pH計(jì)、磁力攪拌器、滅菌鍋、培養(yǎng)箱、氣相色譜儀、糖度計(jì)、離心機(jī)、純水儀、電泳儀、研缽、酒精燈等。

        1.2 培養(yǎng)基

        ②土豆培養(yǎng)基:土豆20%、葡萄糖2%、瓊脂2%。

        ③牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基):牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%。

        復(fù)篩培養(yǎng)基:①發(fā)酵培養(yǎng)基:大米粉5%、葡萄糖1%、蛋白胨1%、硫酸鎂0.03%、氯化鈣0.1%、KH2PO40.5%、NaCl 0.5%。

        鑒定培養(yǎng)基:①察氏培養(yǎng)基:蔗糖3%、硝酸鈉0.3%、七水硫酸鎂0.05%、氯化鉀0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸亞鐵0.001%、瓊脂2%。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 菌株篩選

        1.3.1.1 預(yù)處理

        將酒曲研磨成粉狀,準(zhǔn)確稱取1 g加入裝有100 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中。加入滅菌的玻璃珠放入搖床,180 r/min振蕩30 min。取1 mL樣液并加入9 mL無菌生理鹽水,配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度菌懸液。

        1.3.1.2 初級(jí)篩選

        伴隨科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,為水輪發(fā)電機(jī)組容量的增大創(chuàng)造了良好的條件。水輪發(fā)電機(jī)組作為水電站最重要的設(shè)備,與水電站的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益密切相關(guān)。為了確保水輪發(fā)電機(jī)組安全穩(wěn)定地運(yùn)行,就必須對(duì)其配置進(jìn)行可靠的保護(hù)。由于不同容量的水輪發(fā)電機(jī)組,其保護(hù)配置與特點(diǎn)不盡相同,但是無論怎么配置,都必須確保所配置保護(hù)動(dòng)作可靠、經(jīng)濟(jì)合理,最大程度降低水輪發(fā)電機(jī)組因故障造成的損害,提升機(jī)組運(yùn)行的高效性、安全性,促進(jìn)水電站實(shí)現(xiàn)最大化經(jīng)濟(jì)效益。

        將上述菌液涂布于牛奶培養(yǎng)基上,32℃恒溫2~5 d。觀察菌落周圍有無透明圈出現(xiàn),并測(cè)量透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比。并將得到的菌株接種于土豆培養(yǎng)基上,培養(yǎng)2~3 d,甘油管保存?zhèn)溆肹2]。

        1.3.1.3 復(fù)篩

        將得到的純種菌株接種于種子培養(yǎng)基中,以5%接種量轉(zhuǎn)接種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中,32℃培養(yǎng)5~7 d。發(fā)酵結(jié)束后按照GB/T 13662—2018測(cè)量發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量,同時(shí)測(cè)量蛋白酶酶活,挑選性質(zhì)優(yōu)良的菌株作為目的菌株[3]。

        在pH3.0,40℃的條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 g酪氨酸,定義為1個(gè)蛋白酶活力單位(U/g)。

        1.3.2 產(chǎn)酶曲線以5%接種量轉(zhuǎn)接種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中,180 r/min、30℃搖床培養(yǎng),每隔24 h取5 mL菌液,按照斐林酚法測(cè)定酸性蛋白酶酶活,繪制不同時(shí)間下蛋白酶活曲線[4]。

        1.3.3 菌種鑒定

        將篩選得到的目的菌株編號(hào)為CX1,并進(jìn)行菌種鑒定。

        菌落菌株觀察:經(jīng)過稀釋涂布、平板劃線、鏡檢,觀察到菌落形狀和菌株形態(tài)。

        18s rRNA菌株鑒定:取培養(yǎng)基上的菌株于研缽,液氮研磨。將研磨好的菌轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,加入0.6 mL TE(pH 8.0),攪勻,使菌體充分懸浮。加入250μL 10%SDS,倒轉(zhuǎn)混勻。加入3μL蛋白酶K(20 ng/μL),輕輕混勻,37℃水浴1 h。加入150μL 5 mol/L NaCl,輕輕混勻。加入150μL 2%CTAB,輕輕混勻,65℃水浴20 min。12000 r/min常溫離心20 min。取上清液移至新的15 mL離心管,加入等體積異丙醇,充分混勻,室溫放置30 min,12000 r/min,4℃離心10 min。棄上清液,在吸水紙上吸干液體,加750μL 70%vol乙醇,輕彈管壁,使沉淀懸浮并反復(fù)顛倒幾次,12000 r/min,4℃離心2 min。每管加入30μL純化水溶解沉淀(水中加Rnase,終濃度10 ng/μL),用手輕彈管壁,4℃溶解過夜[5]。

        目的菌株CX1利用18s引物(引物序列為ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'、ITS4;5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用常規(guī)PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。得到的PCR產(chǎn)物交由華大基因進(jìn)行測(cè)序鑒定。對(duì)于測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN和Mega X構(gòu)建NJ算法系統(tǒng)進(jìn)化樹,最終確定菌株的進(jìn)化地位。

        1.3.4 毒理試驗(yàn)

        根據(jù)黃曲霉毒素在紫外光下發(fā)熒光,將分離得到的黃曲霉菌株接種在察氏培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)5~7 d后,于360 nm紫外燈下觀測(cè),有熒光斑點(diǎn)的菌株為產(chǎn)毒菌株,沒有則為不產(chǎn)毒菌株[6]。

        1.3.5 菌種應(yīng)用

        1.3.5.1 酒曲制作

        以小麥為主要原料,同時(shí)按照0%、10%、20%、30%、40%、50%麩皮添加量進(jìn)行混合。取原料3%~4%(v/w)的種子液,用無菌水定容至30%(v/w),接入原料中混勻。32℃培養(yǎng)5~7 d后進(jìn)行干燥處理。

        1.3.5.2 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

        將得到的酒曲進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

        (1)選擇無蟲蛀、無霉變、無雜質(zhì)的干凈大米按重量比1∶1.5~1∶2與水浸泡12~18 h,108℃下蒸煮20 min,取大米質(zhì)量30~50%(v/w)的無菌水進(jìn)行冷卻。

        (2)稱取0.8%米飯質(zhì)量的麥曲,充分混勻,待發(fā)酵5~7 d后,10000 r/min離心5 min取上清液,保存?zhèn)溆谩?/p>

        將得到的上清液進(jìn)行理化實(shí)驗(yàn),檢測(cè)其總糖、氨基態(tài)氮含量。同時(shí)利用氣相色譜對(duì)其風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)[7-8]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌株篩選

        將牛奶培養(yǎng)基篩選出來的菌株利用土豆培養(yǎng)基進(jìn)行劃線純化,純化后的菌株編號(hào)為1、2、3、4、5、6,并進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),測(cè)定蛋白酶酶活(圖1-I)和氨基態(tài)氮含量(圖1-II)。得到目的菌株,命名為CX1,其初始酶活為95 U/mL,發(fā)酵產(chǎn)物中氨基態(tài)氮含量為1.1 g/L。

        2.2 菌種鑒定

        目的菌株CX1進(jìn)行菌落(圖2左)與菌株(圖2右)形態(tài)觀察,初步鑒定為霉菌。

        對(duì)目的菌株CX1進(jìn)行測(cè)序鑒定,測(cè)序結(jié)果通過Blast進(jìn)行比對(duì)。利用Mega X與DNAMAN進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制(圖3),最終確定為Aspergillus flavus。

        2.3 產(chǎn)酶曲線

        每隔24 h取5 mL的CX1發(fā)酵液進(jìn)行酶活檢測(cè),圖4說明1 d時(shí)蛋白酶活力較低,為71 U/mL,4 d時(shí)蛋白酶活力達(dá)到最高值196 U/mL、7 d時(shí)酶活力下降為101 U/mL,發(fā)現(xiàn)其最佳產(chǎn)酶時(shí)間為4 d,此時(shí)酶活力達(dá)到最大值。

        2.4 毒理試驗(yàn)

        圖1 菌株蛋白酶酶活及氨基態(tài)氮含量

        圖2 CX1菌落圖與菌株形態(tài)圖

        根據(jù)黃曲霉毒素在紫外光下顯色,將分離得到的黃曲霉菌株接種在YES培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)7 d后,于紫外燈下觀測(cè),CX1菌株(圖5左)與文獻(xiàn)中產(chǎn)黃曲霉毒素菌株(圖5右)進(jìn)行對(duì)比[9],圖5左結(jié)果顯示,CX1菌株不產(chǎn)熒光斑點(diǎn),此黃曲霉不產(chǎn)毒素。

        2.5 菌株應(yīng)用

        對(duì)黃酒發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行檢測(cè),圖6-I說明當(dāng)麩皮含量為20%、30%、40%時(shí)糖化力最高,能夠達(dá)到96.95 g/L。圖6-II說明麩皮添加量為0%、20%時(shí)氨基態(tài)氮含量較高,能達(dá)到1.51 g/L,當(dāng)麩皮含量為50%時(shí),氨基態(tài)氮含量最低為0.96 g/L,酒中主要的揮發(fā)性物質(zhì)為異丁醇、己偶姻、乙酸糠酯、5-甲基糠醛和4-甲基愈創(chuàng)木酚。氨基態(tài)氮含量較高,可以解決大部分廠家黃酒中氨基態(tài)氮含量不能達(dá)標(biāo)的技術(shù)難題。

        圖3 黃曲霉菌株CX 1與近源菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

        圖4 蛋白酶活曲線

        圖5 紫外燈下黃曲霉顯色圖

        3 結(jié)論與討論

        從酒曲中篩選得到6株產(chǎn)蛋白酶的菌株,編號(hào)為CX1、CX2、CX3、CX4、CX5、CX6。通過斐林酚法復(fù)篩,得到高蛋白酶活力菌株CX1。對(duì)CX1進(jìn)行鑒定,確定其為黃曲霉。利用黃曲霉毒素在紫外燈下有熒光反應(yīng)進(jìn)行毒理試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)無熒光斑點(diǎn),檢測(cè)無毒。CX1的蛋白酶活力最高可達(dá)到196 U/mL,進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)測(cè)得氨基態(tài)氮1.51 g/L、糖度96.95 g/L。氨基態(tài)氮大于優(yōu)質(zhì)甜型黃酒的標(biāo)準(zhǔn)值。

        圖6 糖度、氨基態(tài)氮含量

        CX1菌株蛋白酶活力較強(qiáng),在黃酒發(fā)酵中能產(chǎn)生大量的氨基態(tài)氮。能解決大部分中小型廠家氨基態(tài)氮含量不符合最低生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)際生產(chǎn)問題。但CX1菌株的發(fā)酵產(chǎn)物糖度值和酒精度較低,為了滿足生產(chǎn)要求可以與高糖化力和高發(fā)酵力的菌株進(jìn)行復(fù)配。同時(shí)對(duì)黃酒的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化,使生產(chǎn)工藝與菌株相適應(yīng)。

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