陳 孝，溫承坤，張 玉，李小強(qiáng)，方尚玲，陳茂彬

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)中心，湖北武漢 430068）

黃酒作為一種發(fā)酵酒，氨基態(tài)氮（氨基酸）含量是其中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。氨基酸是組成生命的重要元素，是人體不可或缺的物質(zhì)，同時(shí)在代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。人體有8種必需氨基酸不能合成，需要從外界食物中攝入。目前很多中小型廠家黃酒中氨基酸含量較低，不能夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)中的最低值。黃酒中氨基酸主要來源于原材料中蛋白質(zhì)的分解。本研究主要是為了增加黃酒發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)分解力，通過提高氨基酸含量來完善黃酒品質(zhì)，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：酒曲，主要來源于麻城、房縣和孝感等酒廠；大米和小麥。

試劑：Rnase、異丙醇、乙醇、SDS、無水乙醇、1X T（pH 8.0）、Folin試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、酪蛋白、酪氨酸溶液等。

儀器設(shè)備：電子分析天平、搖床、pH計(jì)、磁力攪拌器、滅菌鍋、培養(yǎng)箱、氣相色譜儀、糖度計(jì)、離心機(jī)、純水儀、電泳儀、研缽、酒精燈等。

1.2 培養(yǎng)基

②土豆培養(yǎng)基：土豆20%、葡萄糖2%、瓊脂2%。

③牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%。

復(fù)篩培養(yǎng)基：①發(fā)酵培養(yǎng)基：大米粉5%、葡萄糖1%、蛋白胨1%、硫酸鎂0.03%、氯化鈣0.1%、KH2PO40.5%、NaCl 0.5%。

鑒定培養(yǎng)基：①察氏培養(yǎng)基：蔗糖3%、硝酸鈉0.3%、七水硫酸鎂0.05%、氯化鉀0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸亞鐵0.001%、瓊脂2%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株篩選

1.3.1.1 預(yù)處理

將酒曲研磨成粉狀，準(zhǔn)確稱取1 g加入裝有100 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中。加入滅菌的玻璃珠放入搖床，180 r/min振蕩30 min。取1 mL樣液并加入9 mL無菌生理鹽水，配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度菌懸液。

1.3.1.2 初級(jí)篩選

伴隨科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，為水輪發(fā)電機(jī)組容量的增大創(chuàng)造了良好的條件。水輪發(fā)電機(jī)組作為水電站最重要的設(shè)備，與水電站的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益密切相關(guān)。為了確保水輪發(fā)電機(jī)組安全穩(wěn)定地運(yùn)行，就必須對(duì)其配置進(jìn)行可靠的保護(hù)。由于不同容量的水輪發(fā)電機(jī)組，其保護(hù)配置與特點(diǎn)不盡相同，但是無論怎么配置，都必須確保所配置保護(hù)動(dòng)作可靠、經(jīng)濟(jì)合理，最大程度降低水輪發(fā)電機(jī)組因故障造成的損害，提升機(jī)組運(yùn)行的高效性、安全性，促進(jìn)水電站實(shí)現(xiàn)最大化經(jīng)濟(jì)效益。

將上述菌液涂布于牛奶培養(yǎng)基上，32℃恒溫2～5 d。觀察菌落周圍有無透明圈出現(xiàn)，并測(cè)量透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比。并將得到的菌株接種于土豆培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3 d，甘油管保存?zhèn)溆肹2]。

1.3.1.3 復(fù)篩

將得到的純種菌株接種于種子培養(yǎng)基中，以5%接種量轉(zhuǎn)接種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)5～7 d。發(fā)酵結(jié)束后按照GB/T 13662—2018測(cè)量發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量，同時(shí)測(cè)量蛋白酶酶活，挑選性質(zhì)優(yōu)良的菌株作為目的菌株[3]。

在pH3.0，40℃的條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 g酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位(U/g)。

1.3.2 產(chǎn)酶曲線以5%接種量轉(zhuǎn)接種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min、30℃搖床培養(yǎng)，每隔24 h取5 mL菌液，按照斐林酚法測(cè)定酸性蛋白酶酶活，繪制不同時(shí)間下蛋白酶活曲線[4]。

1.3.3 菌種鑒定

將篩選得到的目的菌株編號(hào)為CX1，并進(jìn)行菌種鑒定。

菌落菌株觀察：經(jīng)過稀釋涂布、平板劃線、鏡檢，觀察到菌落形狀和菌株形態(tài)。

18s rRNA菌株鑒定：取培養(yǎng)基上的菌株于研缽，液氮研磨。將研磨好的菌轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入0.6 mL TE(pH 8.0)，攪勻，使菌體充分懸浮。加入250μL 10%SDS，倒轉(zhuǎn)混勻。加入3μL蛋白酶K(20 ng/μL)，輕輕混勻，37℃水浴1 h。加入150μL 5 mol/L NaCl，輕輕混勻。加入150μL 2%CTAB，輕輕混勻，65℃水浴20 min。12000 r/min常溫離心20 min。取上清液移至新的15 mL離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置30 min，12000 r/min，4℃離心10 min。棄上清液，在吸水紙上吸干液體，加750μL 70%vol乙醇，輕彈管壁，使沉淀懸浮并反復(fù)顛倒幾次，12000 r/min，4℃離心2 min。每管加入30μL純化水溶解沉淀(水中加Rnase,終濃度10 ng/μL)，用手輕彈管壁，4℃溶解過夜[5]。

目的菌株CX1利用18s引物(引物序列為ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'、ITS4；5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用常規(guī)PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。得到的PCR產(chǎn)物交由華大基因進(jìn)行測(cè)序鑒定。對(duì)于測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN和Mega X構(gòu)建NJ算法系統(tǒng)進(jìn)化樹，最終確定菌株的進(jìn)化地位。

1.3.4 毒理試驗(yàn)

根據(jù)黃曲霉毒素在紫外光下發(fā)熒光，將分離得到的黃曲霉菌株接種在察氏培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5～7 d后，于360 nm紫外燈下觀測(cè)，有熒光斑點(diǎn)的菌株為產(chǎn)毒菌株，沒有則為不產(chǎn)毒菌株[6]。

1.3.5 菌種應(yīng)用

1.3.5.1 酒曲制作

以小麥為主要原料，同時(shí)按照0%、10%、20%、30%、40%、50%麩皮添加量進(jìn)行混合。取原料3%～4%（v/w）的種子液，用無菌水定容至30%（v/w），接入原料中混勻。32℃培養(yǎng)5～7 d后進(jìn)行干燥處理。

1.3.5.2 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將得到的酒曲進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

(1)選擇無蟲蛀、無霉變、無雜質(zhì)的干凈大米按重量比1∶1.5～1∶2與水浸泡12～18 h，108℃下蒸煮20 min，取大米質(zhì)量30～50%（v/w）的無菌水進(jìn)行冷卻。

(2)稱取0.8%米飯質(zhì)量的麥曲，充分混勻，待發(fā)酵5～7 d后，10000 r/min離心5 min取上清液，保存?zhèn)溆谩?/p>

將得到的上清液進(jìn)行理化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其總糖、氨基態(tài)氮含量。同時(shí)利用氣相色譜對(duì)其風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)[7-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

將牛奶培養(yǎng)基篩選出來的菌株利用土豆培養(yǎng)基進(jìn)行劃線純化，純化后的菌株編號(hào)為1、2、3、4、5、6，并進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定蛋白酶酶活（圖1-I）和氨基態(tài)氮含量（圖1-II）。得到目的菌株，命名為CX1，其初始酶活為95 U/mL，發(fā)酵產(chǎn)物中氨基態(tài)氮含量為1.1 g/L。

2.2 菌種鑒定

目的菌株CX1進(jìn)行菌落（圖2左）與菌株（圖2右）形態(tài)觀察，初步鑒定為霉菌。

對(duì)目的菌株CX1進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果通過Blast進(jìn)行比對(duì)。利用Mega X與DNAMAN進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制（圖3），最終確定為Aspergillus flavus。

2.3 產(chǎn)酶曲線

每隔24 h取5 mL的CX1發(fā)酵液進(jìn)行酶活檢測(cè)，圖4說明1 d時(shí)蛋白酶活力較低，為71 U/mL，4 d時(shí)蛋白酶活力達(dá)到最高值196 U/mL、7 d時(shí)酶活力下降為101 U/mL，發(fā)現(xiàn)其最佳產(chǎn)酶時(shí)間為4 d，此時(shí)酶活力達(dá)到最大值。

2.4 毒理試驗(yàn)

圖1 菌株蛋白酶酶活及氨基態(tài)氮含量

圖2 CX1菌落圖與菌株形態(tài)圖

根據(jù)黃曲霉毒素在紫外光下顯色，將分離得到的黃曲霉菌株接種在YES培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7 d后，于紫外燈下觀測(cè)，CX1菌株（圖5左）與文獻(xiàn)中產(chǎn)黃曲霉毒素菌株（圖5右）進(jìn)行對(duì)比[9]，圖5左結(jié)果顯示，CX1菌株不產(chǎn)熒光斑點(diǎn)，此黃曲霉不產(chǎn)毒素。

2.5 菌株應(yīng)用

對(duì)黃酒發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，圖6-I說明當(dāng)麩皮含量為20%、30%、40%時(shí)糖化力最高，能夠達(dá)到96.95 g/L。圖6-II說明麩皮添加量為0%、20%時(shí)氨基態(tài)氮含量較高，能達(dá)到1.51 g/L，當(dāng)麩皮含量為50%時(shí)，氨基態(tài)氮含量最低為0.96 g/L，酒中主要的揮發(fā)性物質(zhì)為異丁醇、己偶姻、乙酸糠酯、5-甲基糠醛和4-甲基愈創(chuàng)木酚。氨基態(tài)氮含量較高，可以解決大部分廠家黃酒中氨基態(tài)氮含量不能達(dá)標(biāo)的技術(shù)難題。

圖3 黃曲霉菌株CX 1與近源菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 蛋白酶活曲線

圖5 紫外燈下黃曲霉顯色圖

3 結(jié)論與討論

從酒曲中篩選得到6株產(chǎn)蛋白酶的菌株，編號(hào)為CX1、CX2、CX3、CX4、CX5、CX6。通過斐林酚法復(fù)篩，得到高蛋白酶活力菌株CX1。對(duì)CX1進(jìn)行鑒定，確定其為黃曲霉。利用黃曲霉毒素在紫外燈下有熒光反應(yīng)進(jìn)行毒理試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)無熒光斑點(diǎn)，檢測(cè)無毒。CX1的蛋白酶活力最高可達(dá)到196 U/mL，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)測(cè)得氨基態(tài)氮1.51 g/L、糖度96.95 g/L。氨基態(tài)氮大于優(yōu)質(zhì)甜型黃酒的標(biāo)準(zhǔn)值。

圖6 糖度、氨基態(tài)氮含量

CX1菌株蛋白酶活力較強(qiáng)，在黃酒發(fā)酵中能產(chǎn)生大量的氨基態(tài)氮。能解決大部分中小型廠家氨基態(tài)氮含量不符合最低生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)際生產(chǎn)問題。但CX1菌株的發(fā)酵產(chǎn)物糖度值和酒精度較低，為了滿足生產(chǎn)要求可以與高糖化力和高發(fā)酵力的菌株進(jìn)行復(fù)配。同時(shí)對(duì)黃酒的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，使生產(chǎn)工藝與菌株相適應(yīng)。