韓聽鋒 李春燕 侯青霞 岳青芬

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，侵襲力強，復發(fā)率高，其致死率居女性惡性腫瘤的首位[1]。miRNA 是長度約為22個核苷酸大小的非編碼RNA，通過抑制目的基因的翻譯或降解目的基因，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達的作用[2, 3]。多項研究發(fā)現(xiàn)miR-495-3p具有抑癌作用，對多種腫瘤的生長具有調(diào)控作用[4]。本研究旨在觀察微小RNA-495-3p在卵巢癌組織和細胞株的表達，進一步通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)觀察miR-495-3p對卵巢癌SKOV-3細胞凋亡、增殖的影響及確切機制。

材料與方法

1.實驗材料：選取筆者醫(yī)院2016年3月～2016年11月經(jīng)手術(shù)切除的新鮮卵巢癌組織標本10例；患者年齡31～69 歲，平均年齡46.87±14.64歲，卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌3例，卵巢漿液性癌7例；根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2000年標準進行分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期6例；標本均經(jīng)組織病理學確診，經(jīng)筆者醫(yī)院倫理學委員會批準及患者知情同意，取其卵巢癌原發(fā)腫瘤組織和癌旁組織(距離癌灶邊緣>5cm)標本。所有患者術(shù)前均未接受放、化療。HEK293細胞、人卵巢癌細胞株(A2780、SKOV-3、HO-8910、OC3)和正常卵巢上皮細胞IOSE80購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所。DMEM/F12 培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。RNA提取試劑盒和熒光實時定量試劑盒購自日本TaKaRa公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司。miR-495-3p mimics和miR-NC購自廣州市銳博生物科技有限公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自武漢博士德公司。一抗β-Actin、NF90、p53、p21、Bcl-2、Bax和辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司。增強型化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。pGL3熒光素酶檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司。

2.方法：(1)細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：在37°C、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)A2780、SKOV-3、IOSE80和HEK293細胞，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HO-8910和OC3細胞。選取對數(shù)生長期細胞以3×105個/孔接種于6孔板。按照試劑盒說明書，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染。細胞分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)和miR-495-3p組(轉(zhuǎn)染miR-495-3p)。(2)熒光實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測miR-495-3p和靶基因mRNA表達：Trizol法提取組織或細胞總RNA，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加樣反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按照熒光實時定量試劑盒說明書進行qPCR。采用2-△△Ct法計算NF90相對于內(nèi)參GAPDH及miR-495-3p相對于內(nèi)參U6的表達量。引物序列見表1。(3)流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞凋亡：將轉(zhuǎn)染48h后的細胞消化收集，嚴格按照Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒說明書操作，PBS溶液洗3次，500μl細胞結(jié)合液重懸細胞，分別加入5μl Annexin Ⅴ和5μl PI，4℃避光反應20min，流式細胞儀檢測并分析各組細胞凋亡率。(4)CCK-8法檢測細胞活力：將對數(shù)生長期的SKOV-3細胞重懸后以5000個/孔接種于96孔板，分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5天向96孔板加入CCK-8 10微升/孔，搖床低速震蕩10s，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，酶標儀檢測各孔在波長為450nm處的A值，以時間為橫軸，A值為縱軸，繪制細胞生長曲線，評估細胞活力變化。(5)平板克隆實驗：轉(zhuǎn)染48h收集兩組細胞，重懸計數(shù)細胞，以1000個/孔接種于新的6孔板。培養(yǎng)14天后用PBS溶液浸洗2次，加甲醇1ml固定15min，棄去固定液，加結(jié)晶紫染液染色10min，自來水沖洗，在倒置顯微鏡下計數(shù)含50個細胞以上的集落觀察細胞形成的克隆數(shù)。(6)Western blot法檢測目的蛋白表達：收集細胞，細胞裂解液裂解，提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。取40μg蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2h。一抗4℃孵育過夜。Tris-HCl緩沖液(TBST)洗3次，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2h，增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯影并進行圖像分析。(7)熒光素酶活性檢測：構(gòu)建野生型及突變型 NF90-3′UTR的報告基因質(zhì)粒，突變區(qū)域見圖1，并將野生型、突變型分別與miR-495-3p和miR-NC共轉(zhuǎn)染入HEK293細胞中，48h后按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書，使用酶標儀檢測各組螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以螢火蟲熒光強度/海腎熒光強度比值反映各組的相對熒光強度。

表1 qPCR引物序列

圖1 野生型NF90 mRNA的3′-UTR區(qū)域含有miR-495-3p靶向結(jié)合片段

結(jié) 果

1.miR-495-3p在卵巢癌組織的表達:qPCR結(jié)果顯示，miR-495-3p在卵巢癌組織和癌旁組織的表達水平分別為0.78±0.09、1.90±0.17，miR-495-3p在卵巢癌組織中表達明顯低于高于癌旁組織(t=5.78，P<0.01,圖2)。

圖2 qPCR檢測卵巢癌及癌旁組織的miR-495-3p水平與癌旁組織比較，*P<0.01

2.miR-495-3p在卵巢癌細胞株的表達:qPCR結(jié)果顯示，miR-495-3p在正常卵巢上皮細胞IOSE80和卵巢癌細胞A2780、SKOV-3、HO-8910、OC3的表達量分別為1.03±0.29、0.35±0.10、0.18±0.04、0.46±0.05、0.60±0.09，miR-495-3p在卵巢癌細胞中的表達顯著降低(P<0.05)。miR-495-3p在SKOV-3表達水平最低，與正常卵巢上皮細胞IOSE80及其他卵巢癌細胞株比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。故選擇SKOV-3細胞進行后續(xù)實驗(圖3)。

圖3 qPCR檢測卵巢癌細胞株及正常卵巢上皮細胞的miR-495-3p水平與IOSE80比較，*P<0.05，**P<0.01

3.轉(zhuǎn)染miR-495-3p對SKOV-3細胞miR-495-3p表達的影響：qPCR結(jié)果顯示，SKOV-3細胞轉(zhuǎn)染miR-495-3p后miR-495-3p表達較對照組顯著升高(18.46±2.59 vs 1.05±0.33，t=13.35，P<0.01)。

4.轉(zhuǎn)染miR-495-3p對SKOV-3細胞凋亡的影響:流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，SKOV-3細胞轉(zhuǎn)染miR-495-3p后凋亡率較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,表2)。

5.轉(zhuǎn)染miR-495-3p對SKOV-3細胞增殖能力影響:平板克隆實驗顯示見表2，實驗組SKOV-3細胞克隆形成數(shù)顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 miR-495-3p對卵巢癌細胞凋亡和增殖能力的影響

6.轉(zhuǎn)染miR-495-3p對SKOV-3細胞活力影響:采用CCK-8 法檢測不同時間點SKOV-3細胞的生長，并繪制生長曲線。細胞生長至第4天，對照組和實驗組細胞A值分別為1.32±0.16和0.94±0.11，第5天對照組和實驗組細胞A值分別為2.09±0.25和1.51±0.13，對照組細胞A值顯著高于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖4)。

圖4 CCK-8 法檢測轉(zhuǎn)染miR-495-3p后不同時點SKOV-3細胞活力的變化與實驗組比較，*P<0.01

7.轉(zhuǎn)染miR-495-3p對SKOV-3細胞NF90 mRNA表達的影響:qPCR結(jié)果顯示，SKOV-3細胞轉(zhuǎn)染miR-495-3p后NF90 mRNA表達較對照組顯著降低(0.37±0.16 vs 1.00±0.06，t=7.54，P<0.01)。

8.轉(zhuǎn)染miR-495-3p對SKOV-3細胞NF90相關(guān)蛋白表達的影響:Western blot法檢測結(jié)果顯示， SKOV-3細胞轉(zhuǎn)染miR-495-3p后NF90、Bcl-2蛋白表達較對照組顯著下調(diào)，p53、p21、Bax蛋白表達較對照組顯著上調(diào)(圖5)。

圖5 Western blot法檢測miR-495-3p轉(zhuǎn)染SKOV-3細胞后目的蛋白的表達水平1.實驗組；2.對照組

9.熒光素酶報告基因?qū)嶒?熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，野生型質(zhì)粒與miR-NC或miR-495-3p共轉(zhuǎn)染SKOV-3細胞后，兩組細胞熒光素酶活性分別為1.02±0.22和0.39±0.10(P<0.01)，表明miR-495-3p可顯著抑制野生型 NF90-3′ UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的熒光素酶活性，而對突變型NF90-3′ UTR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的熒光素酶活性并無影響。該結(jié)果證實，NF90是miR-495-3p的直接作用靶點，miR-495-3p對NF90的表達存在負調(diào)控(圖6)。

圖6 熒光素酶報告基因驗證SKOV-3細胞中miR-495-3p與NF90-3′ UTR的靶向結(jié)合與突變型比較，*P<0.01

討 論

miRNA通過與靶基因的3′-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，誘導mRNA降解或者抑制mRNA翻譯，調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達，參與腫瘤的起始和進展[5]。越來越多miRNA如miR-18b、miR-630、miR-29b等[6～8]被發(fā)現(xiàn)與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miR-495-3p在多種腫瘤中表達異常，可作為腫瘤抑制因子起作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。非小細胞肺癌中miR-495-3p顯著下調(diào)，miR-495-3p通過靶向轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白3抑制肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[9]。miR-495-3p的表達水平在膠質(zhì)瘤組織和細胞株中下調(diào)，體外研究表明miR-495-3p可通過直接抑制MYB表達，干擾膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲[10]。miR-495-3p在臨床食管癌組織中的表達比癌旁組織低，miR-495-3p表達水平與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲和TNM分期相關(guān)。miR-495-3p通過靶向Akt1，抑制細胞周期轉(zhuǎn)變和EMT信號通路，從而抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲[11]。miR-495-3p的表達在腎癌細胞系和組織中均下調(diào)，miR-495-3p的過表達可誘導G0/G1期停滯并抑制腎癌細胞的增殖和遷移，SATB1是miR-495-3p的直接靶標[12]。miR-495-3p還可通過靶向Akt和mTOR信號通路，體內(nèi)體外抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[13]。miR-495-3p在卵巢癌中的作用未見報道。

本研究結(jié)果顯示，miR-495-3p在10例臨床卵巢癌組織及卵巢癌細胞株中顯著低表達，提示miR-495-3p可能參與了卵巢癌的發(fā)生和進展。筆者通過轉(zhuǎn)染miR-495-3p至卵巢癌細胞SKOV-3，發(fā)現(xiàn)SKOV-3細胞活力和增殖能力明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，提示miR-495-3p具有抑癌效應。生物信息學軟件分析顯示核因子蛋白90(NF90)可能是miR-495-3p的靶基因。NF90是ILF3基因的可變剪接體之一，主要包含雙鏈RNA 結(jié)合基序、鋅指結(jié)構(gòu)域及入核、出核序列等，在調(diào)節(jié)真核基因轉(zhuǎn)錄與翻譯、調(diào)控 miRNA 前體成熟等方面具有重要作用，可表現(xiàn)為癌基因的作用[14, 15]。本研究結(jié)果顯示過表達miR-495-3p后，細胞中NF90蛋白明顯下調(diào)。熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測進一步表明NF90是miR-495-3p的靶基因。有文獻表明NF90蛋白表達下調(diào)將誘導抑癌基因p53、p21表達水平的上升，從而對腫瘤的生長發(fā)揮抑制作用[16]。Bcl-2是抑制細胞凋亡蛋白，而Bax是促進細胞凋亡蛋白[17]。本研究結(jié)果表明，過表達miR-495-3p后，抑癌蛋白p53、p21的表達上調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達明顯升高，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下降。本研究的不足之處在于沒有驗證miR-495-3p在體內(nèi)是否同樣具有抑制卵巢癌細胞增殖的作用。筆者下一步將通過裸鼠荷瘤實驗觀察miR-495-3p在體內(nèi)對卵巢癌細胞增殖的抑制作用。

綜上所述，本實驗初步研究表明miR-495-3p通過抑制NF90基因的表達，提高p53和p21蛋白的表達，促進卵巢癌細胞的凋亡，抑制細胞增殖，為miRNA未來可能應用于卵巢癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。