曹旭丹 任春梅 和田田 李素華 李 莉

及時(shí)恢復(fù)血流是臨床上治療急性心肌梗死的首選方案，但缺血再灌注損傷嚴(yán)重影響該患者預(yù)后，而心律失常則是其主要表現(xiàn)形式，超過(guò)50%的死亡病例的致死原因是心肌缺血再灌注所致心律失常，因此防治心律失?；蛟S是提高急性心肌梗死臨床療效的可靠途徑[1,2]。水飛薊賓(Silibinin，SIL)是一種具有抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞再生等多種生物活性的水飛薊素[3,4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，SIL能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、改善心功能等而對(duì)心肌缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用[5～7]。但SIL是否對(duì)心肌缺血再灌注所致心律失常具有影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)制備大鼠心肌缺血再灌注性心律失常模型并提前給予SIL進(jìn)行預(yù)處理，研究SIL對(duì)心肌缺血再灌注性心律失常的影響并探索其機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:實(shí)驗(yàn)用SD大鼠(雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量250～300g，鼠齡8周齡)購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫23～25℃、相對(duì)濕度65%～70%，光照周期12h∶12h，手術(shù)前24h禁食、自由飲水。

2.試驗(yàn)藥物與試劑:水飛薊賓膠囊(天津天士力制藥股份有限公司，藥品規(guī)格：35mg/粒，批號(hào)：20171103)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170624、20170813、20171008)；一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20161229、20170316)；Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20161130、20160924)；鈣標(biāo)準(zhǔn)液(上海生物制品研究所)。

3.實(shí)驗(yàn)方法：(1)動(dòng)物分組、造模與給藥:取120只實(shí)驗(yàn)用SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和SIL低[100mg/(kg·d)]、中[200mg/(kg·d)]、高[400mg/(kg·d)]劑量組和維拉帕米組[2.5mg/(kg·d)]，各20只。術(shù)前7天開始灌胃給藥(1次/天)，正常對(duì)照組和模型組同步灌胃給予0.9%氯化鈉溶液。參照柴麗娜等[8]報(bào)道的通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制大鼠心肌缺血再灌注性心律失常模型；假手術(shù)組除不結(jié)扎外，其余操作同模型組。參照Z(yǔ)hang等[9]報(bào)道的方法對(duì)造模結(jié)果進(jìn)行判斷，心電圖ST段抬高、心肌局部變蒼白表示結(jié)扎并缺血成功；松開動(dòng)脈夾后蒼白區(qū)心肌恢復(fù)紅潤(rùn)、ST段抬高程度恢復(fù)1/2以上則表示再灌注成功。(2)Ⅱ?qū)?lián)心電指標(biāo)監(jiān)測(cè):記錄心電圖PR間期、QRS間期以及ST段變化，計(jì)算各組大鼠室性心動(dòng)過(guò)速(VT)、心室顫動(dòng)(VF)發(fā)生率；然后參照李濤等[10]報(bào)道的方法進(jìn)行心律失常評(píng)分：<5次室性前期收縮，計(jì)0分；僅≥5次室性前期收縮，計(jì)1分；僅<60s室性心動(dòng)過(guò)速，計(jì)2分；一陣≥60s或多陣?yán)塾?jì)<60s室性心動(dòng)過(guò)速，計(jì)3分；多陣VT累計(jì)>60s，計(jì)4分；出現(xiàn)VF計(jì)5分。(3)心肌組織生化指標(biāo)檢測(cè)：麻醉后取心臟組織，剪碎，研磨勻漿，經(jīng)3000r/min低溫(4℃)離心15min后取上清液，遵照試劑盒步驟處理后通過(guò)紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定Na+-K+ATPase、 Ca2+-Mg2+ATPase、SOD、GSH-Px活性和MDA含量；通過(guò)原子吸收光度計(jì)測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度；采用催化L-Arg比色法測(cè)定NOS活性，硝酸酶還原法檢測(cè)NO含量。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.心電圖監(jiān)測(cè)結(jié)果:模型組大鼠心電圖PR、QRS間期較假手術(shù)組均顯著縮短，ST段明顯升高(P<0.01)；而與模型組比較，經(jīng)SIL中、高劑量組或維拉帕米組預(yù)處理能夠顯著延長(zhǎng)心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心電圖PR間期和QRS間期，降低ST段抬高程度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著SIL給藥劑量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心電圖PR間期和QRS間期呈延長(zhǎng)趨勢(shì)，ST段抬高程度呈降低趨勢(shì)。SIL高劑量組與維拉帕米組比較，PR、QRS間期和ST段比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 各組大鼠心電圖監(jiān)測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，ΔP<0.01

2.心律失常發(fā)生率及評(píng)分:模型組室性心動(dòng)過(guò)速(VT)、心室顫動(dòng)(VF)發(fā)生率較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)，心律失常評(píng)分顯著升高(P<0.01)；而與模型組比較，經(jīng)SIL中、高劑量組或維拉帕米組預(yù)處理能夠顯著降低心肌缺血再灌注性心律失常大鼠VT、VF發(fā)生率并降低心律失常評(píng)分(P<0.05)。與SIL低劑量組比較，SIL高劑量組大鼠VT、VF發(fā)生率顯著降低且心律失常評(píng)分顯著降低(P<0.05)。與維拉帕米組比較，SIL高劑量組VT、VF發(fā)生率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，心律失常評(píng)分顯著降低(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠VT、VF發(fā)生率和心律失常評(píng)分

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，ΔP<0.01；與維拉帕米組比較，▲P<0.05

3.ATPase活性和Ca2+濃度:模型組大鼠心肌組織Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性較假手術(shù)組降低且心肌細(xì)胞Ca2+濃度升高(P<0.01)；而與模型組比較，經(jīng)SIL中、高劑量組或維拉帕米組預(yù)處理能夠顯著提高心肌缺血再灌注性心律失常大鼠Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性并降低Ca2+濃度(P<0.05)。隨著SIL給藥劑量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性呈升高趨勢(shì)，Ca2+濃度顯著降低(P<0.05)。與維拉帕米組比較，SIL高劑量組Na+-K+ATPase活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Ca2+-Mg2+ATPase活性顯著升高且Ca2+濃度顯著降低(P<0.05,表3)。

表3 各組大鼠心肌組織ATPase活性及Ca2+濃度

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，ΔP<0.01；與維拉帕米組比較，▲P<0.05

4.NOS活性和NO含量:模型組大鼠心肌組織NOS活性和NO含量較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)；而與模型組比較，經(jīng)SIL中、高劑量組預(yù)處理能夠顯著提高心肌缺血再灌注性心律失常大鼠NOS活性和NO含量(P<0.05)。隨著SIL給藥劑量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心肌組織NOS活性和NO含量均呈升高趨勢(shì)。與維拉帕米組比較，SIL高劑量組NOS活性和NO含量均顯著升高(P<0.05，表4)。

表4 各組大鼠心肌組織NOS活性和NO含量

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，ΔP<0.01；與維拉帕米組比較，▲P<0.05

5.抗氧化酶活性和MDA含量:模型組心肌組織抗氧化酶SOD、GSH-Px活性較假手術(shù)組明顯降低且MDA含量明顯升高(P<0.01)；而與模型組比較，經(jīng)SIL中、高劑量組預(yù)處理能夠顯著降低心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心肌組織SOD、GSH-Px活性并顯著降低MDA含量(P<0.05)，經(jīng)維拉帕米組預(yù)處理能夠顯著提高SOD活性并降低MDA含量(P<0.05)。隨著SIL給藥劑量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心肌組織SOD、GSH-Px活性呈升高趨勢(shì)，MDA含量呈降低趨勢(shì)。與維拉帕米組比較，SIL高劑量組GSH-Px活性顯著升高且和MDA含量均顯著降低(P<0.05)，SOD活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表5)。

討 論

心律失常是心肌缺血再灌注損傷的主要表現(xiàn)形式之一，以室性心動(dòng)過(guò)速(VT)、心室顫動(dòng)(VF)等較為多見，此外還有心房顫動(dòng)、房室傳導(dǎo)阻滯等，并且心律失常是急性心肌梗死再灌注后死亡的主要原因之一[11～13]。維拉帕米是一種鈣離子拮抗劑，是臨床上治療心律失常的一線用藥[9]。本實(shí)驗(yàn)選擇維拉帕米作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

表5 各組大鼠心肌組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，ΔP<0.01；與維拉帕米組比較，▲P<0.05

水飛薊賓(Silibinin，SIL)是一種表現(xiàn)出多種生物學(xué)活性的水飛薊素，本研究通過(guò)制備大鼠心肌缺血再灌注性心律失常模型并于造模前7天給予SIL進(jìn)行預(yù)處理，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)SIL預(yù)處理能夠改善缺血再灌注性心律失常大鼠心律失常狀況，表現(xiàn)為延長(zhǎng)心電圖PR、QRS間期并降低ST段抬高程度，降低VT、VF發(fā)生率，降低心律失常評(píng)分，說(shuō)明SIL具有抑制或緩解心肌缺血再灌注所致心律失常風(fēng)險(xiǎn)的作用，并且該作用呈一定的劑量相關(guān)性。

能量代謝障礙是心肌缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制，ATP合成受阻將導(dǎo)致依賴ATP的Ca2+-Mg2+ATPase活力降低，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+泵出能力下降，導(dǎo)致心肌細(xì)胞Ca2+超載進(jìn)而引發(fā)心律失常[10,14，15]。氧化應(yīng)激損傷和能量耗竭將導(dǎo)致Na+-K+ATPase活力進(jìn)一步降低，進(jìn)而使細(xì)胞外K+增多，導(dǎo)致缺血中央至邊緣區(qū)K+含量逐漸下降的不均勻分布態(tài)勢(shì)，這也是導(dǎo)致心律失常的重要原因之一[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)SIL預(yù)處理能夠明顯改善缺血再灌注性心律失常大鼠心肌組織Ca2+-Mg2+ATPase、Na+-K+ATPase活力并降低心肌細(xì)胞Ca2+含量，改善SOD、GSH-Px活性并降低氧化應(yīng)激損傷，SIL上述作用呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性，這可能是SIL能夠抑制心肌缺血再灌注后發(fā)生心律失常的重要分子機(jī)制。

NO具有調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈血流量、改善缺血心肌細(xì)胞灌流而減輕室性心律失常的生理學(xué)作用，并且能夠通過(guò)降低心肌收縮力、減少心肌耗氧量，從而提高心肌細(xì)胞氧供/需比[17]。NOS是機(jī)體內(nèi)促進(jìn)NO生產(chǎn)的酶。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SIL預(yù)處理能夠改善NOS活性并提高NO含量，并且隨著SIL劑量升高，上述作用增強(qiáng)，這可能也是SIL抑制心肌缺血再灌注性心律失常的機(jī)制之一。

綜上所述，SIL對(duì)大鼠心肌缺血再灌注所致心律失常具有一定的劑量相關(guān)性保護(hù)作用，可能與SIL能夠改善ATPase活性、降低心肌細(xì)胞Ca2+濃度、提高NO含量、抑制氧化應(yīng)激等有關(guān)。