吳朋朋 白 冰 張彩勤 趙 勇 苗海港 師長(zhǎng)宏

(空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

小鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB14922.2—2011)中規(guī)定的實(shí)驗(yàn)用鼠病毒學(xué)重要檢測(cè)項(xiàng)目。MHV具有高度傳染性，但在鼠群中通常以潛伏性感染存在，并可通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播。當(dāng)感染小鼠群免疫功能下降時(shí)，即可能引起整個(gè)鼠群爆發(fā)性的急性感染，導(dǎo)致動(dòng)物大量死亡，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生產(chǎn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[1]。除此之外，小鼠肝炎病毒感染后會(huì)引起小鼠各種免疫應(yīng)答參數(shù)的改變，干擾試驗(yàn)結(jié)果，影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[2-3]。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB14922.2—2011)規(guī)定實(shí)驗(yàn)用小鼠每3個(gè)月至少進(jìn)行一次微生物檢測(cè)，故MHV血清抗體的檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)用小鼠質(zhì)量控制的重要舉措[4-5]。然而，現(xiàn)今已分離到的MHV病毒株有MHV1、MHV2、MHV3、JHM、A59、MHV-S、MHV-Z、MHV-U等[6]，不同的MHV毒株因其嗜組織性不同具有不同的致病性，如JHM為嗜神經(jīng)毒性，MHV3為嗜肝性，A59同時(shí)具有嗜神經(jīng)毒性和嗜肝性?xún)煞N特性[7-8]。由于MHV有多個(gè)毒株，在研制ELISA抗體檢測(cè)試劑盒時(shí)，選用哪些毒株作為檢測(cè)用的抗原，將直接影響到血清抗體檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏感性。各國(guó)及各地區(qū)MHV流行情況不一樣，所選用的毒株也各不相同[9]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T14926.22—2001)規(guī)定了MHV1、MHV3、JHM和A59 4種病毒作為MHV抗體檢測(cè)的抗原[10]。

本實(shí)驗(yàn)室每季度都會(huì)對(duì)本地區(qū)飼養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行病毒檢測(cè)，采用的方法是ELISA監(jiān)測(cè)(GB/T14926.50—2001)、免疫熒光復(fù)檢(GB/T14926.52—2001)和核酸測(cè)序確診[11]。其中MHV抗體水平檢測(cè)采用的是國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的ELISA檢測(cè)試劑盒。使用中發(fā)現(xiàn)ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果和IFA抗體檢測(cè)結(jié)果存在一定差異，具體表現(xiàn)在：當(dāng)血清抗體水平處于判定臨界值左右時(shí)(0.15～0.22)，ELISA抗體檢測(cè)陰性結(jié)果在IFA復(fù)檢時(shí)存在29.7%的陽(yáng)性結(jié)果(11/37)，病毒核酸測(cè)序結(jié)果也提示本地區(qū)的MHV流行毒株與ELISA抗原包被的MHV病毒株有所不同。為了獲得適合本地區(qū)MHV抗體檢測(cè)的ELISA方法，本研究選取了3種MHV毒株MHV1、JHM和A59，通過(guò)L929細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)獲得純化濃縮抗原，篩選獲得了適合本地區(qū)的包被抗原類(lèi)型，優(yōu)化了ELISA反應(yīng)體系，建立了規(guī)范化的MHV血清抗體檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源

小鼠肝炎病毒MHV1(ATCC VR-261)、MHV-JHM(ATCC VR-765)、MHV-A59(ATCC VR-764)購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)；細(xì)胞L929購(gòu)于國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及其他添加劑均為Hyclone公司產(chǎn)品；小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠仙臺(tái)病毒(SV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、呼腸孤病毒III型(Reo3)、小鼠細(xì)小病毒(MVM)和鼠痘病毒(Ect)陽(yáng)性血清購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；HRP-羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體購(gòu)買(mǎi)于A(yíng)bcam公司；酶標(biāo)儀購(gòu)于Bio-rad公司；超速離心機(jī)購(gòu)于Beckman公司；商品化MHV抗體ELISA診斷試劑盒購(gòu)買(mǎi)于國(guó)內(nèi)某公司；165份小鼠血清由本實(shí)驗(yàn)室保存。

SPF級(jí)BALB/C小鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量25～27 g，購(gòu)于北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2014-001]，隔離飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物設(shè)施[SYXK(陜)2014-001]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)了空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)17034)。

1.2 病毒的擴(kuò)增及純化

將購(gòu)買(mǎi)的3株小鼠肝炎病毒MHV-A59、MHV1和MHV-JHM冰上融化后分別用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋(0、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40)后接種到培養(yǎng)成單層的L929細(xì)胞中，同時(shí)以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照孔，在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h(每30 min搖晃一下細(xì)胞)，孵育結(jié)束后棄掉病毒孵育液補(bǔ)加適量的完全細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)繼續(xù)于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。

將出現(xiàn)病變的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融5次，每組取少量病毒凍融液用于病毒滴度測(cè)定，其余凍融液經(jīng)56 ℃ 30 min滅活處理后，5 000 r/min離心30 min，除去細(xì)胞碎片，收集上清病毒液再4 ℃超速離心(25 000 r/min，82 700 g)3 h以濃縮病毒，將濃縮后的病毒液作為抗原用于后期的ELISA檢測(cè)板包被[12]。

1.3 病毒滴度(TCID50)測(cè)定

將擴(kuò)增后的病毒液10倍梯度稀釋(10-1～10-8共8個(gè)梯度)后接種到L929細(xì)胞中，每個(gè)梯度8個(gè)重復(fù)，72 h后觀(guān)察細(xì)胞病變情況，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度[13]。

1.4 血清的制備

陽(yáng)性對(duì)照血清制備：取滅活的3種MHV病毒等體積混合液接種6～8周齡SPF級(jí)BALB/C小鼠30只，免疫程序參考侯麗波等[14]方法，接種方法如下：第1天完全佐劑+病毒液(50 μg)每只小鼠肌肉注射0.1 mL，腹腔注射0.2 mL；第14天不完全佐劑+病毒液(50 μg)每只小鼠肌肉注射0.1 mL，腹腔注射0.2 mL；第21天不完全佐劑+病毒液(50 μg)每只小鼠肌肉注射0.1 mL，腹腔注射0.2 mL；第28天不完全佐劑+病毒液(50 μg)每只小鼠肌肉注射0.1 mL，腹腔注射0.2 mL。分別于免疫后第1、3、5、7、14、21、28、35、42天采血測(cè)定MHV抗體，確定最佳采血時(shí)間。抗體△A值介于1.0～1.5之間的稀釋血清均可作為后續(xù)ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照血清。

陰性對(duì)照血清制備：收集排除MHV感染的SPF級(jí)BALB/C小鼠血清，經(jīng)MHV抗體檢測(cè)抗體△A值小于0.2的稀釋血清均可作為后續(xù)ELISA檢測(cè)的陰性對(duì)照血清。

165份待檢血清制備：采取待檢小鼠的血液500 μL以上，室溫靜置后離心分離血清，儲(chǔ)藏在-80 ℃冰箱中備用。

1.5 ELISA反應(yīng)體系的優(yōu)化

用不同稀釋倍數(shù)的病毒濃縮液包被ELISA酶標(biāo)板，測(cè)定梯度稀釋的免疫血清和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照血清的A值，挑選出最為合適的病毒包被濃度、封閉液濃度以及血清稀釋倍數(shù)，并比較在不同的反應(yīng)條件下免疫血清檢測(cè)結(jié)果的差異，確定適合本實(shí)驗(yàn)室的最佳反應(yīng)條件。

1.6 血清樣品的檢測(cè)及判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

按照優(yōu)化的最佳ELISA反應(yīng)條件與步驟，隨機(jī)選取50份已知抗體濃度的免疫血清，用本研究制備的診斷試劑盒進(jìn)行抗體濃度的測(cè)定，取波長(zhǎng)492 nm和405 nm，讀取各孔A值，結(jié)果以A492減A405(△A)表示。

結(jié)果判定：陽(yáng)性對(duì)照△A值≥0.2，陰性對(duì)照△A值<0.2，同時(shí)滿(mǎn)足以上兩個(gè)條件實(shí)驗(yàn)成立；否則不成立。

以已知陽(yáng)性臨界血清測(cè)量值為參考，計(jì)算出陰性血清樣品平均△A值和標(biāo)準(zhǔn)差SD，且每份陰性樣品△A值是通過(guò)3次ELISA測(cè)定求的平均值，進(jìn)而計(jì)算出陽(yáng)性判定臨界值(cut-off value)：臨界值=陰性樣品的平均△A值+3SD。

1.7 檢測(cè)體系的質(zhì)量控制

特異性試驗(yàn)：按照優(yōu)化好的最適ELISA反應(yīng)條件與步驟，用本試劑盒分別檢測(cè)MHV、SV、PVM、Reo3、MVM和Ect陽(yáng)性血清，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，同時(shí)做陰性和陽(yáng)性對(duì)照孔，分別計(jì)算每份血清的△A均值，從而確定本試劑盒的特異性。

重復(fù)性試驗(yàn)：用本試劑盒在相同的試驗(yàn)條件下，將5份ELISA陽(yáng)性樣品，2份ELISA陰性樣品，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，分別計(jì)算每份血清的△A均值(average value，AV)、標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation，SD)、變異系數(shù)(the coefficient of variation，CV)。同時(shí)用不同批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行批次間重復(fù)性檢驗(yàn)。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：為評(píng)價(jià)所建立的ELISA檢測(cè)方法的穩(wěn)定性，將包被好的ELISA酶標(biāo)板分別置于37 ℃、25 ℃、4℃環(huán)境，每天取出1塊，連續(xù)測(cè)定7 d，觀(guān)察陽(yáng)性血清樣品和陰性血清樣品的△A值的變化。

靈敏度試驗(yàn)：將MHV陽(yáng)性血清做倍比稀釋?zhuān)瑱z測(cè)本研究制備的試劑盒所能檢測(cè)出的最低抗體滴度。

1.8 性能評(píng)價(jià)與初步應(yīng)用

用本研究制備的ELISA診斷試劑盒與商品化MHV ELISA試劑盒平行檢測(cè)165份小鼠血清樣品，評(píng)價(jià)本研究制備的試劑盒與商品化試劑盒的檢測(cè)結(jié)果符合率。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

所有計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)表示，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)組間進(jìn)行分析比較，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 病毒的擴(kuò)增及病毒滴度的測(cè)定

L929細(xì)胞感染MHV-JHM病毒株36 h即可觀(guān)察到細(xì)胞病變，48～60 h病變最為明顯，72 h后細(xì)胞逐漸崩解；MHV-A59和MHV1毒株則于感染48 h以后出現(xiàn)細(xì)胞病變，病變明顯時(shí)間段為60～72 h，隨后細(xì)胞逐漸崩解(圖1)，分別在感染96 h后收取3種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行病毒滴度測(cè)定(圖2)，發(fā)現(xiàn)3種病毒的最佳接種濃度(病毒稀釋倍數(shù))均不相同，MHV1(1∶5稀釋)、MHV-A59(1∶10稀釋)、MHV-JHM(1∶20稀釋)。病毒培養(yǎng)物經(jīng)56 ℃ 30 min滅活處理后，5 000 r/min離心30 min除去細(xì)胞碎片，收集上清病毒液再經(jīng)4 ℃超速離心(25 000 r/min，82 700 g)3 h濃縮病毒，將濃縮后的病毒液作為抗原用于后期的酶標(biāo)板包被。

圖1 不同MHV感染L929細(xì)胞出現(xiàn)的細(xì)胞病變(72 h，×10)注：A：MHV-A59；B：MHV1；C：MHV-JHM；D：L929細(xì)胞Fig.1 The cytopathic effect inoculated with L929 in 72 hourNote：A：MHV-A59；B：MHV1；C：MHV-JHM；D：L929

圖2 不同稀釋倍數(shù)MHV感染L929細(xì)胞96 h病毒滴度Fig.2 L929 cells were infected with different dilutions of MHV at 96 h

2.2 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清的制備

如圖3所示，BALB/C小鼠感染MHV后，第3天即可檢測(cè)到抗體水平，5～7 d抗體水平開(kāi)始快速升高，21 d左右抗體水平的△A值達(dá)到1.0以上，在35 d達(dá)到最高峰并維持一段時(shí)間，因此可于免疫后35 d采取全部小鼠血清，MHV抗體滴度(△A)介于1.0～1.5之間的稀釋血清均可作為后續(xù)ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照血清。

圖3 MHV免疫BALB/C小鼠血清MHV抗體變化Fig.3 The antibody variation of SPF mice(BALB/C)inoculated with MHV

2.3 ELISA反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.3.1病毒類(lèi)型及包被濃度：分別用滅活的3種小鼠肝炎病毒MHV-A59、MHV1和MHV-JHM病毒包被ELISA酶標(biāo)板孔，測(cè)定已知濃度的免疫陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)血清的△A值，每組3個(gè)重復(fù)，以△A值最大為最優(yōu)的包被病毒，結(jié)果如圖4所示，MHV1包被的ELISA酶標(biāo)板測(cè)定的血清濃度更為接近商品化試劑盒，與A59和JHM包被的ELISA酶標(biāo)板測(cè)定的血清濃度差異顯著(P<0.05)。

圖4 不同MHV測(cè)定小鼠血清MHV抗體注：C1-C6：C57BL/6J小鼠血清；B1-B4：BALB/C小鼠血清；K2：昆明小鼠血清；Positive：MHV陽(yáng)性血清； Negative：MHV陰性血清；BLANK:空白對(duì)照Fig.4 The MHV antibody of mice test with different MHVNote：C1-C6：C57BL/6J；B1-B4：BALB/C；K2：Kunming；Positive：MHV antibody positive serum sample； Negative：MHV antibody negative serum sample；BLANK: MHV antigen-free control

MHV1病毒濃縮液用包被緩沖液稀釋為不同濃度(0、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40)包被ELISA酶標(biāo)板孔，測(cè)定已知濃度的免疫陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)血清的△A值，每組3個(gè)重復(fù)，以△A值最大為最優(yōu)的病毒包被濃度。結(jié)果顯示，1∶10倍稀釋的MHV1包被的ELISA酶標(biāo)板測(cè)定的血清濃度更為接近商品化試劑盒，與其他稀釋倍數(shù)組(0、1∶5、1∶20、1∶40)包被的ELISA酶標(biāo)板測(cè)定的血清濃度差異顯著(P<0.05)。故本實(shí)驗(yàn)采用1∶10倍的病毒稀釋濃度為最優(yōu)的病毒包被濃度(即病毒包被濃度為10-7.73/0.1 mL TCID50，抗原蛋白濃度為4.0 μg/mL)。

2.3.2待檢血清工作濃度的優(yōu)化：將待檢血清做0、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀釋?zhuān)瑫r(shí)設(shè)3個(gè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照(不稀釋)，每組3個(gè)重復(fù)，100 μL/孔，孵育時(shí)間均為60 min，測(cè)定不同稀釋濃度的待檢血清的△A值，以△A值最大為待檢血清工作濃度。結(jié)果顯示，1∶40倍稀釋血清的濃度更為接近商品化試劑盒，與其它血清稀釋組(0、1∶10、1∶20、1∶80、1∶160)測(cè)定的結(jié)果差異顯著(P<0.05)，故本實(shí)驗(yàn)采用1∶40稀釋的待檢血清濃度為最優(yōu)待檢血清濃度。

2.3.3HRP-羊抗鼠酶標(biāo)抗體工作濃度的優(yōu)化：將HRP-羊抗鼠酶標(biāo)抗體1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000稀釋?zhuān)?00 μL/孔，每組3個(gè)重復(fù)，測(cè)定待檢血清的△A值，以△A值最大為酶標(biāo)抗體工作濃度，孵育時(shí)間均為1 h。結(jié)果顯示，隨著HRP-羊抗鼠酶標(biāo)抗體濃度降低，各組抗體滴度呈緩慢下降的趨勢(shì)，1∶4 000稀釋的酶標(biāo)抗體測(cè)定的血清濃度更為接近商品化試劑盒，故本實(shí)驗(yàn)采用1∶4 000酶標(biāo)抗體稀釋濃度為最優(yōu)酶標(biāo)抗體濃度。

2.3.4顯色時(shí)間的優(yōu)化：每孔加100 μL配好的OPD顯色液[0.2 mol/L Na2HPO42.57 mL，0.1 mol/L檸檬酸2.43 mL，蒸餾水5 mL，鄰苯二胺(OPD)4 mg，3%H2O2150 μL]，37 ℃顯色時(shí)間分別設(shè)為10 min、20 min、40 min、60 min和90 min，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，顯色結(jié)束后加入50 μL終止液(0.5 mol/L H2SO4)終止反應(yīng)；取波長(zhǎng)492 nm和405 nm，讀取各孔A值，結(jié)果以A492減A405(△A)表示，以△A值最大為最佳顯色時(shí)間。結(jié)果顯示，顯色10 min內(nèi)，血清抗體呈現(xiàn)顯著升高的趨勢(shì)，隨后抗體增長(zhǎng)平緩，各顯色時(shí)間組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，因此本實(shí)驗(yàn)采用的最優(yōu)顯色時(shí)間為10 min。

綜上所述，適合本實(shí)驗(yàn)室的最佳ELISA反應(yīng)條件及步驟如下：

濃縮后的病毒液用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至抗原蛋白濃度為4.0 μg/mL，每孔加100 μL，4 ℃包被過(guò)夜，同時(shí)做只加包被液的孔作為空白對(duì)照；棄去病毒液，每孔加入250 μL封閉液(pH 9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液含2.0% BSA)，4 ℃孵育過(guò)夜；將待檢血清做1∶40倍稀釋?zhuān)靠?00 μL，振蕩混勻，37 ℃孵育1 h；PBST(pH 7.4)重復(fù)洗滌5次后甩干液體；每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)抗體(1∶4 000稀釋)，37 ℃孵育1 h；棄去孔內(nèi)液體，重復(fù)上述洗滌步驟；每孔加100 μL OPD顯色液顯色10 min，加入50 μL終止液；取波長(zhǎng)492 nm和405 nm，讀取各孔A值，結(jié)果以A492減A405(△A)表示。

2.4 血清樣品的檢測(cè)及判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

使用本研究制備的診斷試劑，按照優(yōu)化好的ELISA反應(yīng)條件與步驟，隨機(jī)選取本實(shí)驗(yàn)室保存的小鼠血清165份，用于進(jìn)行抗體濃度的測(cè)定，同時(shí)用商品化試劑盒測(cè)定的血清抗體濃度作為對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照△A值≥0.2，陰性對(duì)照△A值<0.2，同時(shí)滿(mǎn)足以上兩個(gè)條件則實(shí)驗(yàn)成立；否則不成立。以已知陽(yáng)性臨界血清測(cè)量值為參考，計(jì)算出陰性血清樣品平均△A值和標(biāo)準(zhǔn)差SD，且每份陰性樣品△A值是通過(guò)三次ELISA測(cè)定求的平均值，進(jìn)而計(jì)算出陽(yáng)性判定臨界值(cut-off value)：臨界值=陰性樣品的平均△A值+3SD。結(jié)果如表1所示。

表1 小鼠MHV血清抗體檢測(cè)Table 1 MHV antibody of mouse serum

2.5 檢測(cè)體系的質(zhì)量控制

使用本研究制備的診斷試劑，按照優(yōu)化好的ELISA反應(yīng)條件與步驟，分別檢測(cè)MHV、SV、PVM、Reo3、MVM和Ect陽(yáng)性血清，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，同時(shí)做陰性和陽(yáng)性對(duì)照孔，分別計(jì)算每份血清的△A均值，從而確定本試劑盒的特異性。結(jié)果如表2所示，只有MHV陽(yáng)性血清的△A值遠(yuǎn)大于0.22判定為陽(yáng)性，ECT和SV陽(yáng)性血清△A值雖處于可疑值范圍之內(nèi)，考慮的陰性血清△A值較高(>0.1)，可視為血清非特異性結(jié)合，PVM、Reo3、MVM陽(yáng)性血清△A值均低于0.17，判定為陰性，表明該方法具有良好的特異性。

表2 特異性檢測(cè)Table 2 Specific tests

重復(fù)性試驗(yàn)：用本試劑盒將5份MHV陽(yáng)性樣品，2份MHV陰性樣品，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，分別計(jì)算每份血清的△A均值(average value，AV)、標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation，SD)、變異系數(shù)(the coefficient of variation，CV)。結(jié)果如表3所示，各組血清的重復(fù)性均良好(CV值<10%)。

表3 批次內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)Table 3 Batch of repeatability tests

同時(shí)用不同批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行批次間重復(fù)性檢驗(yàn)，結(jié)果如表4所示，陰性血清變異系數(shù)偏大(10%)，但也在酶標(biāo)儀測(cè)定誤差范圍之內(nèi)，其余各組血清的重復(fù)性均良好(CV值<10%)。

表4 批次間重復(fù)性檢測(cè)Table 4 Batch to batch repeatability tests

穩(wěn)定性試驗(yàn)：為評(píng)價(jià)所建立的ELISA檢測(cè)方法的穩(wěn)定性，將包被好的ELISA酶標(biāo)板分別置于37 ℃、25 ℃、4℃環(huán)境，每天取出1塊，連續(xù)測(cè)定7 d，觀(guān)察其在405 nm和492 nm波長(zhǎng)處其△A值的變化。結(jié)果如表5所示，孵育環(huán)境(37 ℃)和室溫環(huán)境(25 ℃)，無(wú)論是樣品血清(B3)還是陰陽(yáng)性對(duì)照血清，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(7 d)，MHV血清抗體水平呈緩慢下降的趨勢(shì)且批次間△A值變異系數(shù)偏大(>10%)，不適合試劑盒的長(zhǎng)期儲(chǔ)存；冷藏環(huán)境下(4 ℃)，MHV血清抗體水平各批次間△A值變異系數(shù)最小(<10%)，適合于長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

表5 穩(wěn)定性檢測(cè)Table 5 stability tests

靈敏度試驗(yàn)：將MHV陽(yáng)性血清做倍比稀釋?zhuān)瑱z測(cè)本研究制備的試劑盒所能檢測(cè)出的最低檢出量。結(jié)果如表6所示，陽(yáng)性對(duì)照(2.113)在稀釋倍數(shù)大于1∶4 000時(shí)△A值小于0.22，臨床陽(yáng)性血清B3(0.603)則在稀釋倍數(shù)大于1∶1 000時(shí)△A值小于0.22，具有一定的靈敏性，這與臨床血清本身MHV抗體水平偏低有關(guān)。

表6 靈敏性檢測(cè)Table 6 Sensitivity tests

2.6 性能評(píng)價(jià)與初步應(yīng)用

用本研究制備的ELISA診斷試劑盒與商品化MHV ELISA試劑盒平行檢測(cè)165份小鼠血清樣品，評(píng)價(jià)本研究制備的試劑盒與商品化試劑盒的符合率。陰陽(yáng)性判定結(jié)果如表1所示，陰性樣品符合率為92.91%(118/127)，陽(yáng)性樣品符合率為97.37%(37/38)不符合樣品為10份，主要分布在鄰近商品化試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)附近的血清(0.15～0.22)，需進(jìn)一步復(fù)檢，兩次結(jié)果均為可疑則可判定為陽(yáng)性。

3 討論

由于MHV有多個(gè)毒株亞型，且不同地區(qū)之間MHV流行情況不一樣，所選用的毒株也各不相同。在研制試劑盒時(shí)，選用哪些毒株作為檢測(cè)用的抗原將直接影響到檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏感性，需要根據(jù)不同組織型的MHV選擇不同的包被抗原進(jìn)行檢測(cè)[15]。在實(shí)際應(yīng)用中通常需要用不同的診斷試劑對(duì)同一份樣品反復(fù)進(jìn)行驗(yàn)證，才能確定其準(zhǔn)確結(jié)果。或者采用同時(shí)包被多種抗原類(lèi)型來(lái)達(dá)到一次操作能夠檢測(cè)多種病毒的目的，但由于不同抗原之間的干擾及各地區(qū)實(shí)際感染現(xiàn)狀的差異，結(jié)果準(zhǔn)確性較單一抗原有所降低，容易造成誤判，使整個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體存在隱形感染MHV的風(fēng)險(xiǎn)[16-17]。為此，在全面對(duì)本地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行流行病學(xué)性調(diào)查的基礎(chǔ)上，我們從美國(guó)ATCC購(gòu)買(mǎi)了我國(guó)主要流行的3株小鼠肝炎病毒MHV1(ATCC VR-261)、MHV-JHM(ATCC VR-765)、MHV-A59(ATCC VR-764)作為不同的ELISA包被抗原，用于本地小鼠MHV陽(yáng)性臨床血清抗體的檢測(cè)。

在用L929細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，L929細(xì)胞感染MHV-JHM病毒株36 h即可觀(guān)察到細(xì)胞病變，48～60 h病變最為明顯，72 h后細(xì)胞逐漸崩解；MHV-A59和MHV1毒株則于感染48 h以后出現(xiàn)細(xì)胞病變，病變明顯時(shí)間段為60～72 h，隨后細(xì)胞逐漸崩解(見(jiàn)圖1)，分別在感染96 h后收取3種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行病毒滴度測(cè)定(圖2)，發(fā)現(xiàn)3種病毒的最佳接種濃度(病毒稀釋倍數(shù))均不相同，MHV1(1∶5稀釋)、MHV-A59(1∶10稀釋)、MHV-JHM(1∶20稀釋)，這說(shuō)明病毒的擴(kuò)增有一定的濃度要求。選取最佳接種劑量的小鼠肝炎病毒可以在感染細(xì)胞2～3 d的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)病毒的快速增長(zhǎng)，病毒的培養(yǎng)較為穩(wěn)定，在接種后72 h收獲病毒，符合試劑盒病毒生產(chǎn)的需要。

研究表明MHV-A59與其它毒株之間有交叉反應(yīng)，是一個(gè)有廣泛反應(yīng)性的抗原，曾作為ELISA檢測(cè)的包被抗原，我國(guó)MHV抗體酶標(biāo)檢測(cè)試劑盒主要使用三價(jià)抗原，結(jié)合模式一般為經(jīng)典毒株與新分離毒株相結(jié)合的組合，檢出率也明顯高于單抗原，陽(yáng)性率的差別主要表現(xiàn)在對(duì)弱陽(yáng)性樣品或不確定樣品的陽(yáng)性檢出率上[18-21]。本研究用不同MHV病毒株抗原包被，檢測(cè)本地小鼠MHV陽(yáng)性臨床血清抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于商品化試劑盒測(cè)定的血清抗體濃度，MHV1抗原包被的ELISA酶標(biāo)板測(cè)定的血清陽(yáng)性檢出率更為接近商品化試劑盒，與A59和JHM包被的ELISA酶標(biāo)板測(cè)定的結(jié)果差異顯著(P<0.05)，MHV-A59檢測(cè)結(jié)果只有參考值的一半，MHV-JHM無(wú)論陰陽(yáng)性血清均無(wú)明顯反應(yīng)，這說(shuō)明本地小鼠MHV陽(yáng)性臨床血清主要是MHV1和MHV-A59感染引起，這與前期的病毒核酸測(cè)序鑒定結(jié)果相符。另一方面，該商品化試劑盒的參考陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果MHV-A59和MHV-JHM抗體水平最高，反而MHV1的檢測(cè)結(jié)果最低，這說(shuō)明該試劑盒抗原包被時(shí)雖然都含有以上3種病毒類(lèi)型，但以MHV-A59和MHV-JHM病毒為主，MHV1次之，這與本地區(qū)流行的病毒株有很大的出入，也可能是該試劑盒在使用過(guò)程中ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果和IFA抗體檢測(cè)結(jié)果有著一定的差異的原因之一。

隨后，本研究選取了MHV1作為適合本地區(qū)的包被抗原類(lèi)型并優(yōu)化ELISA反應(yīng)體系，以期獲得一種穩(wěn)定、精密、檢測(cè)準(zhǔn)確的MHV血清抗體ELISA診斷方法，可以用于MHV的日常病原學(xué)監(jiān)測(cè)。通過(guò)對(duì)大量臨床小鼠血清樣本(165)的測(cè)試，小鼠的MHV陰性血清檢測(cè)數(shù)據(jù)多控制在0.07左右，而不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)此標(biāo)準(zhǔn)會(huì)有一定影響，例如顯色時(shí)間和顯色液類(lèi)型，因此我們采取陰性參比血清的檢測(cè)結(jié)果加2SD(陰性ΔA+2SD，0.17)作為陰性判定標(biāo)準(zhǔn)。以此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大量樣品做多次檢測(cè)，檢測(cè)的準(zhǔn)確性達(dá)到92.91%(118/127)，因此在檢測(cè)過(guò)程中低于此標(biāo)準(zhǔn)的樣品可做陰性判定。而高于此標(biāo)準(zhǔn)的血清樣品，仍有少量不能用IFA和Western blot等方法做陽(yáng)性判定，因此在本試劑盒中增設(shè)了陽(yáng)性臨界濃度血清判定指標(biāo)陰性ΔA+3SD(0.22)，當(dāng)ELISA檢測(cè)結(jié)果高于此標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，使用IFA和Western blot等方法可對(duì)此樣品做出一致的判斷。而低于此標(biāo)準(zhǔn)高于陰性判定標(biāo)準(zhǔn)的樣品(0.15～0.22)，其來(lái)源動(dòng)物的種群需要做進(jìn)一步的檢測(cè)來(lái)確認(rèn)。