王正印 尹元 陸群

血吸蟲病是嚴(yán)重危害發(fā)展中國家人民健康的重要寄生蟲病。全球有78個國家和地區(qū)流行血吸蟲病，感染人口接近3億，其中適齡兒童約占46%［1］，為了實現(xiàn)消除血吸蟲病的目標(biāo)，研發(fā)血吸蟲病疫苗成為主要的發(fā)展方向之一［2］。在血吸蟲基因工程疫苗（包括核酸疫苗）研究中，迄今已篩選出多個亞單位候選抗原，可對血吸蟲病的防治起到一定的作用［3～5］。為了研究更有保護(hù)力的血吸蟲疫苗，本文從血吸蟲胰島素受體基因（Schistosoma ja-ponicuminsulin receptor-2，SJIR-2）方面著手，通過構(gòu)建SJIR-2基因的真核表達(dá)載體作為重組疫苗，以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組SJIR-2基因?qū)?93T細(xì)胞，再以Western blot的方法驗證其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，這將為進(jìn)一步探索SJIR-2基因的重組疫苗在血吸蟲病防治中的作用提供幫助。

材料和方法

一、材料

1.日本血吸蟲、真核表達(dá)載體和pEGFP 293T細(xì)胞均來自于安徽醫(yī)科大學(xué)。

2.主要試劑及儀器

Lipo2000和Trizol試劑購自美國invitrogen公司，rTaq mix購自日本TaKaRa公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司，T4連接酶、XmaI和PstI內(nèi)切酶購自北京NEB公司，DNA膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Axygen公司，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG購自北京全式金公司，鼠抗pEGFP購自英國Abcam公司。

二、方法

1.RT-PCR

將日本血吸蟲研碎，用Trizol提取日本血吸蟲的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，SJIR-2基因擴(kuò)增引物SJIR-2-F：GCTGCAGTATGCTAAATATATTGGCTCAACATG；SJIR-2-R：CCCCGGGATAAGCTAAATCTCCATTTGTAATTGTT進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件是：94℃預(yù)變性5 min，接著94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min，4℃停止，共35個循環(huán)。取5μL PCR產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用DNA膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.PCR產(chǎn)物和載體pEGFP的酶切及純化

取pEGFP載體和PCR產(chǎn)物各10μL，用限制性內(nèi)切酶PstI和XmaI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，回收純化酶切DNA片段。

3.SJIR-2基因與pEGFP的重組與鑒定

將pEGFP載體和純化后的SJIR-2基因以1∶3的比例混合，然后加入1μL T4連接酶制成連接反應(yīng)體系，將該連接反應(yīng)體系放進(jìn)16℃溫箱孵育過夜。次日，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)內(nèi)，在卡那抗性培養(yǎng)平板上培養(yǎng)12～16 h，挑取若干單克隆放入3 mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中37℃，200 rpm振搖過夜，提取重組質(zhì)粒。分別采用PCR法、雙酶切法和測序法鑒定重組基因，同時進(jìn)行Blast比對分析。

4.SJIR-2基因在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法分別將pEGFP-SJIR-2重組質(zhì)粒和空pEGFP對照轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)，具體方法如下：①取兩個1.5 mL的EP管，向兩個EP管中加入50μL Opti-MEM培養(yǎng)基，然后向其中一個EP管中加入0.8μg質(zhì)粒，向另一個EP管中加入2μL Lipofectamine 2 000，混勻后室溫靜置5 min。②將兩個EP管中的溶液混合，室溫靜置20 min。③取細(xì)胞密度在90%左右的24孔板，棄掉原有的培養(yǎng)基，向每孔加入400μL不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基，將②中質(zhì)粒和Lipofectamine 2000的混合液加入培養(yǎng)板孔中。④將24孔板放回37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后更換完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總蛋白，Western blot檢測SJIR-2基因所編碼的蛋白表達(dá)情況。

結(jié) 果

一、目的基因SJIR-2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR法擴(kuò)增目的基因得到1575 bp的基因片段，電泳結(jié)果與預(yù)期一致（圖1）。

圖1 目的基因SJIR-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析

二、重組載體pEGFP-SJIR-2的鑒定

用PstI和XmaI雙酶切重組基因可得到2個片段，即1 575 bp處的目的基因片段和約4 700 bp處的pEGFP片段（圖2），將酶切得到的目的基因片段進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast比對與SJIR-2基因序列同源性為100%。

圖2 pEGFP-SJIR-2的PCR及雙酶切鑒定結(jié)果

三、SJIR-2蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

用LiPo 2000分別介導(dǎo)pEGFP和pEGFP-SJIR-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光（圖3）；Western blot檢測出目的蛋白的表達(dá)，與預(yù)測大小一致（圖4）。

圖3 熒光顯微鏡下結(jié)果

圖4 pEGFP和pEGFP-SJIR-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)換293T細(xì)胞SJIR-2 Western blot蛋白表達(dá)結(jié)果

討 論

研制有效的血吸蟲病疫苗是預(yù)防和控制血吸蟲病的必要措施之一［6］。近年來，雖然在血吸蟲疫苗的研究方面取得了一定的成績［7］，但是至今都沒有理想的血吸蟲疫苗問世。葡萄糖和糖原等碳水化合物被認(rèn)為是吸蟲重要的能量來源，葡萄糖和糖原等碳水化合物的代謝離不開胰島素。研究表明［8］胰島素介導(dǎo)糖代謝主要是通過PI3K途徑發(fā)揮作用：胰島素首先與靶細(xì)胞表面的胰島素受體（IR）結(jié)合，激活I(lǐng)Rp的酪氨酸激酶，然后導(dǎo)致一系列IRS的磷酸化，磷酸化的IRS激活P13K，進(jìn)而引起一系列蛋白質(zhì)磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致胰島素的生物效應(yīng)。其中任何一個環(huán)節(jié)改變都可致胰島素生物效應(yīng)降低而產(chǎn)生胰島素抵抗。因為靶細(xì)胞膜上的胰島素受體只需10%～20%與胰島素結(jié)合，便足以發(fā)揮最大生理效應(yīng)，故胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙是胰島素抵抗的主要原因［9］。血吸蟲胰島素受體和人類胰島素受體在配體區(qū)域有相同的結(jié)合機(jī)制，在酪氨酸激酶區(qū)域有一樣的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)加工［10］。研究表明，血吸蟲除了能應(yīng)答自身內(nèi)在的內(nèi)分泌激素，也能接受宿主激素信號調(diào)控增殖、發(fā)育和交配［11］。日本血吸蟲和其哺乳動物宿主分享胰島素受體或胰島素樣生長因子受體的基因片段，能接受宿主激素信號調(diào)控自身的發(fā)育［12，13］。另外在血吸蟲童蟲和成蟲表面表達(dá)的膜蛋白是疫苗和藥物研制合理的目標(biāo)［14］，而胰島素受體就是膜蛋白，可以作為疫苗的抗原分子。本次研究成功構(gòu)建了pEGFP-SJIR-2重組質(zhì)粒，并且驗證了其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，從而可將該重組質(zhì)粒通過一定的方法導(dǎo)入動物體內(nèi)，使該基因編碼的蛋白在宿主體內(nèi)表達(dá)，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性的抗體從而達(dá)到預(yù)防和治療血吸蟲病的目的。這些都為我們進(jìn)一步探索SJIR-2基因的重組疫苗在血吸蟲病防治中的作用打下堅實基礎(chǔ)。