崔大煒，邢育柏，金宏遠，彭雪強，楊良，范慶

（1.遵義醫(yī)科大學第五附屬（珠海）醫(yī)院普通外科，廣東 珠海 519100；2.中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院普通外科，沈陽 110032）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有43.7萬人被確診為HCC，其中約50%發(fā)生在中國［1-2］。盡管隨著外科手術方法和介入、消融等技術的不斷進步，HCC的治療效果得到改善，但患者5年生存率僅約26%［3］。研究肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子學機制，有助于探尋肝癌的早期診斷與靶向治療的新靶點。自噬是細胞通過溶酶體或液泡分解自身組分，以達到維持細胞內(nèi)正常生理活動和穩(wěn)態(tài)的一種細胞代謝過程［4］。自噬在真核生物中保守存在，與人類疾病和健康息息相關，其中在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中能夠通過降解細胞器和蛋白質(zhì)等為腫瘤細胞提供生長所需［5］。通過改變腫瘤細胞的自噬水平從而治療腫瘤，已經(jīng)成為攻克腫瘤的新思路。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是細胞中一類轉錄本長度大于200 nt的非編碼RNA分子，其本身并不具備編碼蛋白的功能［6］。起初認為其無任何編碼功能，但近年來研究［7-8］顯示lncRNA參與了多種生物學過程，尤其是腫瘤的發(fā)病機制。人們發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA在惡性腫瘤中都有差異性表達，并且lncRNA在這些惡性腫瘤中充當致癌基因或抑癌基因［9］。肝癌高表達（highly upregulated in liver cancer，HULC）的lncRNA是第一個在HCC中鑒定出的高表達的lncRNA，可通過調(diào)節(jié)鄰近的蛋白質(zhì)編碼基因來促進肝癌細胞增殖，這意味著HULC在腫瘤細胞的發(fā)展過程中扮演了重要角色［10］。本研究通過檢測lncRNA HULC在人肝癌組織和正常肝組織中的表達情況和體外實驗，探討其對肝癌細胞增殖及自噬水平的影響，為臨床肝癌的靶向治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 標本收集

收集2016年3月至2018年6月間遵義醫(yī)科大學第五附屬（珠海）醫(yī)院肝癌手術切除的60例HCC標本。60例HCC新鮮冰凍組織標本，置液氮冷卻后送-80 ℃冰箱保存。所有組織經(jīng)2名病理醫(yī)師評估，確診為肝癌組織且復查無誤。本研究在醫(yī)院倫理委員會批準和患者簽署知情同意書后進行。

1.2 細胞系和培養(yǎng)條件

肝癌細胞系（HepG2、Bel-7402、SMMC-7721及Huh7）和Chang Liver細胞系均購自中喬新舟生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)選用高糖DMEM，添加10%胎牛血清，另加雙抗（100 μg/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素）的培養(yǎng)基，置于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。每天更換新鮮培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。

1.3 RNA提取與實時PCR

采用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）裂解細胞，以用于細胞內(nèi)總RNA的提取。使用Power SYBR Green（日本TaKaRa公司）做實時PCR分析。結果用GAPDH的表達量標準化。HULC上游引物：5’-TCATGATGGAATTG-GAGCCTT-3’，下游引物：5’-CTCTTCCTG-GCTTGCAGATTG-3’；GAPDH上游引物：5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’，下游引物5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’。實時PCR和數(shù)據(jù)收集基于ABI 7500平臺。HULC相對于GAPDH的表達采用2-ΔΔCt法計算和標準化。

1.4 質(zhì)粒的構建及細胞轉染

HULC過表達質(zhì)粒為上海吉瑪公司合成、鑒定后提供的商用產(chǎn)品（NR_002766.2），為HULC序列亞克隆至pcDNA3.1載體后構建成的質(zhì)粒，pcDNA3.1空白載體作為陰性對照。將肝癌細胞株Bel-7402和HepG2按5×105/孔種于6孔板中，待細胞達到70%融合時，用pcDNA3.1-HULC以及相應的陰性對照（轉染空載質(zhì)粒）通過Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）轉染細胞，6 h后更換培養(yǎng)基，48 h后收獲細胞用于實時PCR檢測，72 h后用于Western blotting檢測。

1.5 CCK-8測定細胞增殖

CCK-8實驗具體步驟按照制造商的標準方案進行。每隔24 h，采用CCK-8試劑（日本同仁化學研究所）檢測1次細胞增殖。將對數(shù)生長期細胞接種在96孔板（1×104/孔），加入CCK-8溶液并孵育3 h。然后通過分光光度法測量每種溶液在490 nm下的吸光度值。設置空白對照組，同時每組分別設置4個復孔取平均值。

1.6 免疫熒光檢測LC3

將爬片放入12孔板中，膠原蛋白包被爬片，紫外線燈照30 min。分別將HepG2和Bel-7402細胞接種于12孔板中，1～2 d換液1次，待細胞貼壁且生長到65%左右，將pcDNA3.1-HULC質(zhì)粒加入培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，PBS清洗3次，每次5 min。隨后用多聚甲醛固定20 min，再用PBS清洗3遍，每次5 min。Triton透膜，牛血清白蛋白封閉，孵育一抗和二抗，DAPI染核。分別以轉染pcDNA3.1的HepG2和Bel-7402細胞為對照組，在熒光顯微鏡下檢測各組肝癌細胞內(nèi)LC3熒光斑點的數(shù)量與分布。

1.7 Western blotting

對細胞用裂解液進行蛋白提取，然后使用SDSPAGE等試劑，將蛋白轉到NC膜（美國Sigma公司）上，用特定抗體孵育，進而檢測特定蛋白（LC3抗體、Atg3和β-actin購自美國ProteinTech公司）的表達。通過放射密度測定法（Quantity One軟件，美國Bio-Rad公司）對放射自顯影圖片進行量化。將β-actin作為對照。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件對結果進行統(tǒng)計與分析。定量資料用表示，采用Studentt檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HULC在肝癌組織和正常肝組織中的表達水平

采用實時PCR 檢測60例肝癌患者樣本中HULC的表達情況。結果顯示，肝癌組織中 HULC 的表達水平顯著高于相鄰正常肝組織（P＜ 0.05）（圖1A）。檢測HULC在人肝癌細胞系HepG2、Bel-7402、SMMC-7721及Huh7中的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)，上述4種肝癌細胞系中HULC的表達水平均高于正常肝細胞系Chang Liver（P＜ 0.05）（圖1B）。由于HULC在HepG2和Bel-7402中的表達相對較低，因此用于后續(xù)轉染pcDNA3.1過表達細胞實驗中。

2.2 過表達HULC促進肝癌細胞增殖

圖1 HULC在肝癌組織和正常肝組織中的表達情況Fig.1 Expression levels of HULC in HCC tissues and normal tissues

首先，在肝癌細胞HepG2和Bel-7402中成功轉染pcDNA3.1-HULC質(zhì)粒。通過實時PCR驗證pcDNA3.1-HULC轉染效率，結果顯示，pcDNA3.1-HULC的轉染效率分別為23倍與31倍（圖2A）。采用CCK-8試劑盒檢測HULC過表達細胞系增殖能力的變化，結果顯示，過表達HULC后肝癌細胞系增殖能力顯著增加（圖2B）。

2.3 過表達HULC表達能夠增強肝癌細胞自噬水平

為了探討HULC對肝癌細胞自噬水平的影響，在轉染了pcDNA3.1-HULC質(zhì)粒的肝癌細胞系HepG2、Bel-7402中，通過Western blotting檢測過表達HULC的肝癌細胞中自噬標志蛋白LC3表達情況。結果顯示，當HepG2和Bel-7402細胞中過表達HULC后，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化增多（圖3A）。這表明HULC能夠促進肝癌細胞自噬。為了判斷HULC對自噬體形成的影響，采用免疫熒光實驗觀察LC3熒光斑點的形成情況。結果顯示，當肝癌細胞過表達HULC時，LC3熒光斑點形成增加（圖3B）。以上結果表明，HULC能夠顯著促進肝癌細胞自噬水平。

2.4 過表達HULC促進肝癌細胞中Atg3表達

為了明確HULC促進肝癌細胞自噬的機制，在轉染pcDNA3.1-HULC質(zhì)粒的肝癌細胞系HepG2、Bel-7402中，采用Western blotting檢測細胞中自噬相關蛋白Atg3的表達。結果顯示，在過表達HULC的肝癌細胞中Atg3表達顯著上調(diào)（圖4A）。這表明HULC可以促進Atg3的表達。

3 討論

lncRNA HULC是在肝癌中特異性高表達的lncRNA。由HULC基因轉錄而來，該基因定位在6p24.3，全長500 nt，含2個外顯子（長度分別為303和182 bp）和1個內(nèi)含子（長度為1 152 bp）。HULC基因轉錄后，產(chǎn)物經(jīng)剪切、加工后形成長度為500 bp的RNA，與mRNA結構類似，具有且poly A尾結構。由于含有多個終止密碼子，無編碼蛋白功能，lncRNA HULC的保守性差導致其基因的多態(tài)性，與腫瘤易感性相關［11］。lncRNA HULC在肝癌組織中特異性高表達可能與肝癌微環(huán)境有關。近年來的研究［12-13］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些異常表達的lncRNA對不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有潛在作用，參與調(diào)控細胞免疫、凋亡、腫瘤侵襲與轉移等惡性生物學行為。另外研究［14］發(fā)現(xiàn)，lncRNA能夠通過表觀遺傳的調(diào)控方式影響腫瘤的生長。目前為止，人們對lncRNA的了解仍處于不斷探索的階段。

圖2 HULC對肝癌細胞HepG2和Bel-7402增殖的影響Fig.2 Effect of pcDNA3.1-HULC on the proliferation of HepG2 and Bel-7402 cells

圖3 HULC對肝癌細胞HepG2和Bel-7402自噬的影響Fig.3 Effect of HULC on autophagy in HepG2 and Bel-7402 cells

圖4 HULC上調(diào)促進肝癌細胞HepG2和Bel-7402中Atg3表達Fig.4 Overexpression of HULC upregulated the expression of Atg3 protein in HepG2 and Bel-7402 cells

研究［15］表明，自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著緊密的聯(lián)系。自噬可通過調(diào)節(jié)腫瘤與腫瘤微環(huán)境的關系來促進腫瘤的存活與增殖。因此，通過促進或者抑制自噬從而治療腫瘤，已經(jīng)成為攻克腫瘤的新思路。隨著人們對lncRNA的認識加深，其在自噬中的作用也逐漸受到人們的關注，一些lncRNA可以抑制自噬的發(fā)生，如Risa、H19等［16］；與之相反，有些lncRNA能夠促進自噬的發(fā)生，如BANCER、NEAT2、PTENT1、HOTAIR等［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)，HULC在肝癌組織中的表達明顯高于正常肝組織，并且在肝癌細胞系中的表達也高于正常肝細胞系。通過成功構建HULC過表達的HepG2和 Bel-7402細胞系，本研究首先檢測了肝癌細胞增殖能力的變化。結果發(fā)現(xiàn)，在過表達HULC的肝癌細胞系中細胞增殖能力顯著增加。同時在自噬水平檢測實驗中，發(fā)現(xiàn)HULC能夠促進肝癌細胞自噬的發(fā)生。而且本研究進一步發(fā)現(xiàn)，HULC能夠顯著誘導Atg3的上調(diào)。

綜上所述，本研究結果提示，HULC在肝癌的發(fā)展過程中扮演著促癌基因的角色，能夠促進自噬的發(fā)生，進而為腫瘤生存提供物質(zhì)與能量基礎。本研究結果可能為肝癌的靶向治療提供新的方向，但具體分子機制有待進一步揭示。