李芮 姚莉* 劉曉明 徐學(xué)敏 王楠 孫豐雷 張洋

（1 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250014；2 德州市第二人民醫(yī)院內(nèi)一科，山東 德州 253000；3 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250000）

動脈粥樣硬化（AS）是心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)。近年來的研究認(rèn)為內(nèi)皮損傷及慢性炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)是血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）損傷，VEC損傷后可表達(dá)黏附分子，后者可使單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互粘附，從而促進(jìn)了AS的發(fā)展［1］。因此，研究內(nèi)皮細(xì)胞功能及代謝的變化對探討AS的發(fā)病機制有重要意義［2］。益脈顆粒以黃芪、丹參、絞股藍(lán)、紅景天、鬼箭羽組方，已經(jīng)臨床觀察證實益脈顆?？梢越档皖i動脈內(nèi)中膜厚度、延緩動脈粥樣硬化進(jìn)程，治療氣虛血瘀型心腦血管疾病安全而有效。本實驗通過觀察益脈顆粒對實驗性兔血脂水平、病理學(xué)以及LOX-1蛋白及基因表達(dá)，旨在氧化應(yīng)激方面深入細(xì)致探討益脈顆粒保護(hù)血管內(nèi)皮、抗動脈粥樣硬化的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康的雄性新西蘭兔24只，稱重（2.02±0.08）kg，由山東省農(nóng)科研究院提供。

1.2 實驗儀器及試劑（1）光學(xué)顯微鏡、全自動生化分析儀：日本Olympus公司；（2）石蠟切片機、包埋機、熒光正置顯微鏡：德國Leica公司；（3）病理圖象分析系統(tǒng)（Image-Pro Plus 5.0）：Media Cybernetics Co.Ltd.USA；（4）DAB Detection Kit：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；（5）LOX-1抗體：美國Abcam公司；（6）手術(shù)顯微鏡、全自動脫水機、PCR儀；（7）麻醉劑：戊巴比妥鈉溶液。

1.3 實驗藥物 益脈顆粒，由山東博康藥業(yè)有限公司加工。

2 實驗方法

2.1 建模 將24只健康雄性新西蘭兔，隨機分為3組，每組8只，第1組為高脂組，飼以高膽固醇飲食（5%的豬油顆粒飼料加1%的膽固醇）；第2組作為中藥組，給予益脈顆粒（1 g·d-1·kg-1）并予高膽固醇飲食（5%豬油顆粒飼料加1%的膽固醇）；第3組為正常對照組，飼正常飲食。3組均喂養(yǎng)4個月。

2.2 采樣及處理標(biāo)本 兔子被處死前禁食12 h，從兔耳緣靜脈采血10 mL，以3400 r/min離心，取血清，存放于－20℃待用。將兔麻醉并固定于手術(shù)臺（麻醉方法：使用濃度為3%的戊巴比妥鈉溶液按照1 mL/kg注射到兔耳緣靜脈），打開兔的胸腔，剝離出胸主動脈后去掉多余組織，置于4%的多聚甲醛中固定，等待備用。將固定的胸主動脈取出，持續(xù)清洗直至干凈，將血管切成長約5 mm的組織塊，放入石蠟包埋機包埋，等到石蠟完全浸入組織塊，冷卻凝固后完成。包埋好的組織塊變得堅硬，切成3～5 mm厚的包切片。等待實驗觀察。

2.3 觀察指標(biāo)（1）測定TC及LDL-C水平采用全自動生化分析儀和生化測定試劑盒，測定總膽固醇（TC）水平和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，單位用mmol/L表示；（2）使用HE染色觀察血管病理形態(tài)學(xué)指標(biāo)。圖象分析使用軟件Image-Pro Plus 5.0；（3）免疫組織化學(xué)染色觀察LOX-1蛋白表達(dá)。使用顯微照相系統(tǒng)觀察LOX-1（陽性呈現(xiàn)棕黃色），照相；（4）實時定量PCR反應(yīng)檢測。使用Trizol抽提RNA，取細(xì)胞總RNA 1μg進(jìn)行RT-PCR，加入10μM Oligo dT、總RNA1ug和DEPC水8μL，混合均勻，在70℃的水中放置5 min，然后迅速降溫2 min，再按照順序加入5×M-MLV reaction buffer 5μL+DEPC水補足混合均勻?；旌蟁T體系，離心，在40℃左右水中放置1 h以合成cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Primix Ex Taq 10μL；forward primer 1 uL；double distilled water 6μL；RT cDNA 2μL；reverse primer 1μL（總共20μL）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3組兔血脂比較 高脂組TC水平（36.65±0.31）mmol/L明顯高于中藥組（27.00±0.53）mmol/L和正常對照組（0.84±0.03）mmol/L（P＜0.05），高脂組的LDL-c（14.09±1.12）mmol/L也明顯高于中藥組（10.04±0.68）mmol/L及正常對照組（0.67±0.99）mmol/L（P＜0.05）。見表1。

表1 3組兔血脂比較（±s，mmol/L）

表1 3組兔血脂比較（±s，mmol/L）

注：中藥組與正常對照組和高脂組比較，☆P＜0.05

3.2 治療后3組兔血管病理形態(tài)學(xué)變化 正常對照組在肉眼觀察下未發(fā)現(xiàn)AS斑塊，在鏡下可以見到完整的內(nèi)膜。中藥組在肉眼觀察下可以看到粥樣硬化斑塊，分布在動脈的內(nèi)膜上，與高脂組相比，斑塊的面積減小，內(nèi)膜增厚。在肉眼觀察下，高脂組的動脈內(nèi)膜上有脂質(zhì)附著，說明AS病變已經(jīng)形成。見表2。

表2 3組兔血管病理形態(tài)學(xué)分析比較（±s）

表2 3組兔血管病理形態(tài)學(xué)分析比較（±s）

注：中藥組與其他2組相比，＊P＜0.05

3.3 3組兔LOX-1蛋白表達(dá) 通過免疫組化染色定量分析，中藥組的LOX-1的蛋白分布較稀疏，而高脂組LOX-1的蛋白分布較密集，提示益脈顆?？赡芤种芁OX-1蛋白的表達(dá)。見表3。

表3 3組兔LOX-1蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 3組兔LOX-1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：中藥組與高脂組比較，■P＜0.05；“-”表示正常對照組LOX-1未測出

3.4 3組兔LOX-1基因發(fā)達(dá) 中藥組LOX-1基因表達(dá)低于高脂組（P＜0.05），說明益脈顆?？梢砸种芁OX-1基因的表達(dá)。見圖1。

圖1 3組兔LOX-1基因表達(dá)

4 討論

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS） 是以血管內(nèi)皮損傷、血小板病理性聚集及炎癥反應(yīng)等多種因素共同參與的病理過程。正常的內(nèi)皮細(xì)胞可以調(diào)節(jié)血管的緊張度，參與凝血過程，同時具有較強的抗炎作用［3］。高脂血癥是公認(rèn)的動脈粥樣硬化誘發(fā)原因之一，高脂使氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL） 異常聚集、分解障礙。血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1（lectin like oxidized low densitylipoprotein receptor-1，LOX-1）作為氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）特異性受體，主要在血管內(nèi)皮表達(dá)。LOX-1參與ox-LDL降解過程，是AS形成的受體之一，血脂正常時，體內(nèi)含量很少。冠狀動脈及頸動脈由于其解剖結(jié)構(gòu)使得血管內(nèi)皮容易損傷，進(jìn)而脂質(zhì)沉積，最終形成動脈粥樣硬化，是心腦血管病潛在危險因素。同時受損的內(nèi)皮細(xì)胞NO合成減少，黏附分子表達(dá)相應(yīng)的增加，引發(fā)內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，加速內(nèi)皮的損傷。

中醫(yī)認(rèn)為，膏脂在體內(nèi)異常堆積，其病位在脾，與肝、腎有著密切的相關(guān)性。本病多因嗜食肥甘，損傷脾土，或者因肝氣郁結(jié)、氣機不暢，或者因腎虛鼓動無力，終致清氣不升、濁氣難降，中焦氣機郁滯，釀生痰濕，化為脂膏，壅滯于脈中則發(fā)為本病。因此在中醫(yī)臨證過程中，提出動脈粥樣硬化為“虛、毒”致病的觀點。其中“虛”為先后天之本虧虛，即脾氣不足、腎氣暗耗，“毒”為致病之邪氣，包括痰毒、瘀毒，在“毒損脈絡(luò)，損絡(luò)生毒”的理論基礎(chǔ)上，以益氣活血、化濕解毒為治療原則，自擬“益脈顆?！?，其藥物組成為黃芪、丹參、絞股藍(lán)、紅景天、鬼箭羽。其中黃芪為君藥，其為補氣之要藥，歸脾、肺經(jīng)，具有補益中土、溫養(yǎng)脾胃之功效。黃芪溫補脾土，脾氣得升、脾陽復(fù)辟，而中州之大氣斡旋矣。而鄒澍在《本經(jīng)疏證》中指出：“黃芪直入中土而行三焦，故能內(nèi)補中氣，中行營氣，下行衛(wèi)氣……。”黃芪一源三派，疏三焦之根，利營衛(wèi)之氣，故凡營衛(wèi)間阻滯，無不盡通。所謂源清流自潔者也。丹參為臣藥，味苦，微寒，具有涼血活血、化瘀通絡(luò)的功效，使得瘀血化、新血生、脈絡(luò)通。絞股藍(lán)，始載于《救荒本草》，具有益氣、安神、清熱解毒、化濕祛痰的功效；紅景天，具有抗腦缺氧、抗疲勞、活血止血、化瘀消腫、解熱退燒、滋補元氣等功效；鬼箭羽，其名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有破血通絡(luò)，解毒消腫的功效，三藥共為佐藥，以協(xié)助君藥補虛、臣藥活血之作用，同時進(jìn)一步化濕、祛痰、解毒，以期清除脈管內(nèi)蓄積的痰、瘀、毒邪。本方五藥合用，使得虛得補，邪得清，氣血和，陰陽平。

總之，從臨床療效及實驗研究這2個不同的手段及層面進(jìn)一步證明，在動脈粥樣硬化早期階段，益脈顆?？梢悦黠@地抑制動脈粥樣硬化LOX-1的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)，改善內(nèi)皮功能，抗動脈粥樣硬化，且臨床療效顯著。