彭華 王維綺 劉蘭 馬珊 代超

（1 云南省中醫(yī)醫(yī)院眼科，云南 昆明 650021；2昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔研究所，云南 昆明 650101）

脈絡膜新生血管（choroidal neovescularization，CNV）是由多種病因所致的脈絡膜新生血管芽穿越Bruch膜，并在視網(wǎng)膜色素上皮層（RPE）下和（或）感覺上皮層下增殖形成的纖維血管組織，常伴有視網(wǎng)膜下的漿液性滲出和（或）出血，易反復出血，晚期形成瘢痕組織，最終導致患者視力喪失，是眼科臨床多種眼底病的共同病理改變，病變主要發(fā)生在眼底黃斑區(qū)，臨床多見于濕性老年性黃斑變性（ARMD）、中心性滲出性脈絡膜視網(wǎng)膜病變（CEC）、高度近視脈絡膜黃斑出血（HM）等眼底病。因CNV可造成患者視力嚴重損害，具有不可逆性，是一類常見的致盲性眼病，目前國內(nèi)外尚無徹底治療手段，是世界公認的難治性眼底病之一。據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)僅AMD患者就有2000～2500萬人，其中80%以上重度視力障礙AMD患者有CNV的形成［1］。如何有效治療CNV是全球眼科界共同關注的熱點問題，故開展CNV的治療研究，對預防致盲，保障人類健康具有十分重要的意義。因此我們采用523 nm激光擊穿Bruch膜的方法建立相關CNV動物模型，觀察CNV生成時間，為治療CNV提供有效的介入時間奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇含有色素的BN大鼠25只，雌雄不限，體質(zhì)量約（170±10）g；由昆明醫(yī)科大學口腔醫(yī)學重點實驗室提供，動物及實驗適用條約符合國家科學技術委員會發(fā)布的《實驗動物管理條例》。

1.1.2 實驗儀器 多波段眼底激光治療儀532 nm激光機（雙子星Viridis-twin，法國光太公司）、眼底血管造影機（德國海德堡HRA/OCT，型號：HRA2-KT-03847）。

1.1.3 實驗試劑 復方托吡卡胺滴眼液（北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術有限責任公司）；熒光素鈉注射液（Alcon Laboratories，Inc.美國）、水合氯醛（由昆明醫(yī)科大學口腔醫(yī)學重點實驗室提供）。

1.2 研究方法

1.2.1 造模方法 按照4 mL·kg-1體質(zhì)量標準腹腔注射100 g·L-1水合氯醛進行麻醉，復方托吡卡胺滴眼液雙眼散瞳，鹽酸奧布卡因滴眼液（倍諾喜）行眼表麻醉，在全視網(wǎng)膜鏡下用半導體激光（波長532 nm），照射部位位于視乳頭及髓線下方，以光凝后有氣泡產(chǎn)生為擊破Bruch膜的標志，激光參數(shù)：功率625～750 mW，時間0.1 s，光斑直徑50μm，點數(shù)30～40。

1.2.2 熒光素眼底血管造影術（FFA）檢查 于造模后每周將25只BN大鼠按照1.5 mL·kg-1體質(zhì)量準腹腔注射100 g·L-1熒光素鈉（0.1 mL/100 g），注射后立即計時，并用眼底照相機進行同步動態(tài)造影觀察視網(wǎng)膜熒光滲漏情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 本次實驗采用Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)對數(shù)字圖片進行分析測量，實驗數(shù)據(jù)用（±s）表示；采用SPSS 18.0軟件進行完全隨機的單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FFA檢查CNV滲漏面積結(jié)果532光凝后7～28 d，F(xiàn)FA檢查顯示CNV滲漏面積呈逐漸增多趨勢。在本實驗造模的480個激光點中，7 d成模率為57.25%，14 d為68.40%，21 d、28 d達到頂峰，分別為74.00%、78.25%。14 d、21 d、28 d CNV滲漏面積與第7天相比，及14 d與28 d CNV滲漏面積相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05））；而21 d與28 d的CNV滲漏面積比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 激光光凝后比較不同時間眼底FFA檢查中的熒光滲漏面積變化（±s）

表1 激光光凝后比較不同時間眼底FFA檢查中的熒光滲漏面積變化（±s）

2.2 眼底FFA結(jié)果FFA顯示，532光凝后7 d，（圖1a）檢查示BN大鼠眼底視網(wǎng)膜光凝斑處存在輕度熒光素滲漏，出現(xiàn)少量CNV；激光光凝后14 d，（圖1b）FFA檢查示眼底視網(wǎng)膜光凝斑處出現(xiàn)中度的熒光素滲漏，CNV面積擴大；532激光光凝后21 d，（圖1c）FFA檢查示BN大鼠眼底視網(wǎng)膜光凝斑處熒光素滲漏呈大片狀，可見強熒光素滲漏，CNV面積進一步擴大；532激光光凝后28 d，（圖1d）FFA檢查示BN大鼠眼底視網(wǎng)膜光凝斑處熒光素滲漏強度趨于穩(wěn)定，與第21 d相比無明顯變化。

圖1 FFA檢查光凝后熒光素滲漏情況

3 討論

脈絡膜新生血管（choroidal neovescularization，CNV）常見于年齡相關性黃斑變性（ARMD）、病理性近視、中心性滲出性脈絡膜視網(wǎng)膜病變等常見的眼底性疾病，黃斑區(qū)域是新生血管主要的好發(fā)區(qū)，輕度時即可出現(xiàn)視力的下降，嚴重時常可導致患者視力不可逆的喪失，是一類常見的致盲性眼病，目前CNV產(chǎn)生的機制尚未完全闡明。研究表明CNV是由多種因素共同作用的結(jié)果，玻璃膜的增厚、變性、破裂等損害是產(chǎn)生脈絡膜來源的新生血管的先決條件［2］。由于正常情況下處于拮抗平衡狀態(tài)的VEGF因子和抗VEGF因子的平衡受到視網(wǎng)膜脈絡膜局部的缺血缺氧，氧化反應、炎性反應等病理破壞，使促和抗血管生成因子在眼內(nèi)的平衡受到破壞，進而激活了血管系統(tǒng)長出新生血管使脈絡膜微循環(huán)的障礙及視網(wǎng)膜色素上皮的功能出現(xiàn)異常，Brunch膜破裂，CNV芽穿越Bruch膜，并在RPE層下和（或）感覺上皮層下增殖形成纖維血管組織［3］。由于新生血管促進因子和抑制因子調(diào)控著血管的新生，正常情況下，他們處于相對平衡狀態(tài)，兩種因子的平衡使血管處于正常的生長狀態(tài)，一旦這兩種因子中的任何一種因子被打破，就會激活血管系統(tǒng)發(fā)芽長出新生血管［4］。

高小燕［5］等通過觀察激光光凝術后BN大鼠的病理切片發(fā)現(xiàn)，正常BN大鼠視網(wǎng)膜、脈絡膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰，Bruch膜破裂時間在光凝后1周出現(xiàn)，并伴有少量脈絡膜新生血管的形成，之后脈絡膜新生血管面積逐漸增加，一直到光凝后8周可見明顯CNV形成。唐坤［6］通過采用CD31免疫組化法觀察激光光凝術后CNV的生長情況，發(fā)現(xiàn)光凝后35 d出現(xiàn)大量完整新生管腔結(jié)構(gòu)，即明顯的CNV的形成，而7 d內(nèi)CNV生長并不明顯。據(jù)報道［7］采用激光光凝誘導的方法，多數(shù)CNV可在2周內(nèi)生成。陶方方［8］通過觀察加減駐景方干預大鼠脈絡膜新生血管形成的機制研究發(fā)現(xiàn)，采用659 nm氪激光光凝后7 d，CNV開始形成，14 d達到頂峰，21 d CNV逐漸穩(wěn)定。鄒秀蘭［9］等采用組織病理學方法觀察發(fā)現(xiàn)光凝后14 d，在光凝區(qū)及附近形成CNV。本實驗研究發(fā)現(xiàn)532激光光凝誘導BN大鼠CNV動物模型的發(fā)生時間在7 d以內(nèi)，7～21 d迅速進展，21～28 d達到峰值，此后CNV達到穩(wěn)定，與文獻報道結(jié)果相似，CNV是嚴重危害人類健康的重大疾病之一。因此，熟練的掌握CNV出現(xiàn)時間，對于合理的介入藥物治療有至關重要的作用。由于個體等差異，沒有準確的觀察到CNV形成的具體時間，只能得出一個時間范圍，在以后的實驗中我們將努力改進實驗方法，總結(jié)出CNV形成的準確時間，為治療此病提供先機。