李哲銘， 劉冬冬， 陳攀， 趙伊立， 孫發(fā)， 邢俊平， 唐開發(fā)*

(1.貴州醫(yī)科大學附院 泌尿外科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省人民醫(yī)院， 貴州 貴陽 550004； 3.西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 泌尿外科， 陜西 西安 710061)

引起男性不育的因素有很多，根據(jù)生殖環(huán)節(jié)可分為睪丸前、睪丸、睪丸后三大因素，特發(fā)性男性不育是指致病原因不明的不育，可能通過其中的一個或多個因素引起[1]?；钚匝?ROS)是正常生理過程的產(chǎn)物，正常水平的ROS有利于維持精子獲能及頂體反應等精子生理功能，而高水平ROS可通過破壞精子結(jié)構(gòu)引起男性不育[2-4]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases，GSTs)能促進親電子物質(zhì)及應激氧化產(chǎn)物與還原型谷胱甘肽結(jié)合，維持氧化還原系統(tǒng)的動態(tài)平衡[5-6]。GSTT1、GSTM1和GSTP1基因編碼Theta、Mu和Pi亞型酶，其不同基因型在人群中存在功能差異[7-8]，影響GSTs酶活性，進而導致機體氧化應激水平的差異[9]。本研究分析GSTT1、GSTM1及GSTP1基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育患者氧化應激水平及精子DNA氧化損傷之間的關系，為臨床特發(fā)性男性不育癥患者的診療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2008年9月-2012年6月泌尿外科門診就診的246例特發(fā)性男性不育癥患者作為受試對象，年齡21～34歲、平均(27.0±3.6)歲。納入標準：(1)有規(guī)律性生活1年以上，未采取任何避孕措施女方未受孕；(2)常規(guī)進行2次或以上精液分析，精子密度小于15×106/mL或精子總數(shù)小于39×106，精子前向活率小于32%[10]。排除已知原因如外傷、隱睪癥、生殖系統(tǒng)感染、染色體核型異常、輸精管道梗阻及血清性激素水平異常等導致的不育。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1GSTT1、GSTM1、GSTP1基因分型 抽取研究對象外周靜脈血3 mL，嚴格按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。參照文獻[11]，采用聚合酶鏈反應(PCR)對GSTT1、GSTM1進行基因分型，采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)對GSTP1基因進行分型，GSTT1、GSTM1、GSTP1及β-actin基因引物均由上海生物工程公司設計并合成。GSTT1基因上游引物為5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3′、下游引物為5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′，GSTM1基因上游引物為5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3′、下游引物為5′-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′，GSTP1基因上游引物為5′-ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3′、下游引物為5′-TGAGGGCAC AAGAAGCCCCT-3′；β-actin為內(nèi)參照，上游引物為5′-ACTCCCCATCCCAAGAC C-3′、下游引物為5′-CCTTAATGTCACGCACGAT-3′[11]。采用Biomltra梯度PCR儀對目的基因進行擴增，反應體系25 μL，反應條件為95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(GSTM1 60 ℃，GSTT1 63 ℃，GSTP1 58 ℃，β-action61 ℃)，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。采用BsmAI(ALW26I)限制性內(nèi)切酶對GSTP1基因擴增產(chǎn)物進行處理，擴增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2精漿及精子DNA中氧化應激相關指標檢測 精液采集方法按第4版《WHO人類精液及精子-宮頸黏液作用實驗室檢驗手冊》[10]標準執(zhí)行：禁欲3～7 d，用手淫法采集精液置于干燥無菌取精杯中，用Chelex-100提取精子總DNA；將精液置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)液化，1 000 r/min離心獲得精漿，采用ELISA法測定精漿中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、總抗氧化能力(T-AOC)水平以及精子DNA中8-羥基脫氧鳥苷(8-OH-dG)水平，嚴格參照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 GSTT1、GSTM1、GSTP1基因多態(tài)性

如圖1、圖2所示，GSTT1基因擴增產(chǎn)物長度為480 bp，GSTM1基因擴增產(chǎn)物長度為219 bp，GSTP1基因擴增產(chǎn)物長度為177 bp；經(jīng)BsmAI(ALW26I)限制性內(nèi)切酶酶切后，野生型(A/A)產(chǎn)物長度為177 bp，突變純合型(G/G)產(chǎn)物長度為87 bp及90 bp，突變雜合型(A/G)產(chǎn)物長度為177 bp、87 bp及90 bp，β-actin內(nèi)參照擴增產(chǎn)物長度為400 bp。246例特發(fā)性男性不育患者中，GSTM1(+)及GSTM1(-)患者分別為97、149例，GSTT1(+)及GSTT1(-)患者分別為92、154例，GSTM1/GSTT1(+/+)、GSTM1/GSTT1(+/-)、GSTM1/GSTT1(-/+)及GSTM1/GSTT1(-/-)患者分別為38、59、54及95例，GSTP1(A/A)GSTP1(A/G+G/G)及患者分別為167、79例。

注：泳道1為陰性對照，泳道2、12為GSTM1/GSTT1(+/+)，泳道3、7、8為GSTM1/GSTT1(-/-)，泳道4、9為GSTM1/GSTT1(+/-)，泳道5、6、10、11為GSTM1/GSTT1(-/+)，M為50 bp DNA maker。圖1 GSTs酶GSTT1及GSTM1基因擴增產(chǎn)物凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis for glutathione S-transferase M1 and T1 gene polymorphisms

注：泳道1為陰性對照，泳道2、6為突變純合型(G/G)，泳道3、4、9、11為野生型(A/A)，泳道5、7、8、12為突變雜合型(A/G)，M為50 bp DNA maker。圖2 GSTs酶GSTP1基因擴增產(chǎn)物經(jīng)BsmAI(ALW26I)酶切后凝膠電泳Fig.2 Gel electrophoresis for GSTP1 gene amplification products digestion by BsmAl enzyme

2.2 GSTT1、GSTM1、GSTP1基因多態(tài)性與精液氧化應激水平

GSTM1(-)組精漿NO及精子DNA中8-OH-dG水平顯著高于GSTM1(+)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；GSTT1(-)組精漿NO及精子DNA中8-OH-dG水平顯著高于GSTT1(+)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；GSTM1/GSTT1(-/-)組精漿MDA、NO及精子DNA中8-OH-dG水平高于GSTM1/GSTT1(+/+)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，精漿T-AOC水平低于GSTM1/GSTT1(+/+)組，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；GSTP1(A/G+G/G)組精漿NO及精子DNA中8-OH-dG水平高于GSTP1(A/A)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，精漿T-AOC水平明顯低于GSTP1(A/A)組，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

3 討論

既往研究認為氧化應激(OS)是影響生殖能力的重要因素之一，精子像其他細胞一樣會產(chǎn)生自由基和活性氧物質(zhì)[12]。OS是機體產(chǎn)生的ROS水平和機體抗氧化水平之間失去平衡后導致的結(jié)果。低水平的ROS被認為是精子的受精、頂體反應及獲能過程所必須，同時低水平的ROS引起脂質(zhì)過氧化，導致細胞膜的改變，從而促進精子和卵母細胞的交互融合[13-14]。正常生育男性精液中ROS與抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，當某些病理因素導致該平衡被打破后，過量的ROS可誘發(fā)精子DNA損傷、精子線粒體膜受損、精子活力下降、畸形精子增多及精子細胞凋亡等,從而導致男性不育[2,15]。

表1 特發(fā)性男性不育患者GSTT1、GSTM1、GSTP1基因多態(tài)性與精液氧化應激水平的關系Tab.1 The oxidative stress levels in GST genotype groups

注：與野生型(+、+/+或A/A)比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

GSTs屬于機體Ⅱ相解毒酶系統(tǒng)，是人體抗氧化系統(tǒng)最重要的成員之一，其可以催化外源性化學物質(zhì)和內(nèi)源性ROS及其代謝產(chǎn)物與還原性谷胱甘肽結(jié)合，進而促進這些有毒物質(zhì)的代謝與滅活，減少對細胞的損害[16-17]。既往研究發(fā)現(xiàn)GSTs的基因多態(tài)性可影響其酶分子結(jié)構(gòu)，從而影響酶的活性[18]。前期通過對精索靜脈曲張患者GSTs基因分型及精液氧化應激水平測定，發(fā)現(xiàn)GSTM1及GSTT1基因缺失型的精索靜脈曲張患者對氧化應激的敏感性較基因野生型患者明顯增高[11]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)在特發(fā)性男性不育癥患者中，GSTM1及GSTT1基因多態(tài)性影響精子對氧化損傷的易感性[19-20]。

本研究采用ELISA方法對246名特發(fā)性男性不育癥患者的精漿MDA、NO、T-AOC及精子DNA中8-OH-dG水平進行檢測，同時對這些患者進行GSTs基因多態(tài)性測定。通過對相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性男性不育患者中GSTM1(-)及GSTT1(-)組中精漿NO及精子DNA中8-OH-dG水平分別顯著高于GSTM1(+)及GSTT1(+)組(P<0.01)，而GSTM1/GSTT1(-/-)組精漿MDA、NO及精子DNA中8-OH-dG水平高于GSTM1/GSTT1(+/+)組(P<0.05)，而精漿T-AOC低于GSTM1/GSTT1(+/+)組(P<0.05)，這就表明GSTT1(+)及GSTM1(+)患者精液氧化應激水平較GSTT1(-)及GSTM1(-)患者處于相對低水平。GSTP1(A/G+G/G)組中NO及精子DNA中8-OH-dG高于GSTP1(A/A)組(P<0.05)，而精漿T-AOC水平顯著低于GSTP1(A/A)組(P<0.01)，意味著基因型為GSTP1(A/G)和GSTP1(G/G)的患者比基因型為GSTP1(A/A)的患者精液氧化應激水平更高。

綜上所述，GSTs基因多態(tài)性可以影響特發(fā)性男性不育患者精漿氧化水平和精子DNA氧化損傷。由于引起特發(fā)性男性不育的機制較為復雜，同時影響機體氧化應激水平的因素有很多，本研究的樣本量較少，且存在地域局限性，有待大樣本、多中心進一步研究。