魏傳飛 王偉 劉延明 段婧 蘆現(xiàn)杰 王琰 張男 李孟鵬陳超 章陽(yáng) 佟加貝 韓發(fā)彬,3

目前，許多疾病如帕金森氏病、阿爾茲海默病和軟骨缺損等是由于組織或器官中的細(xì)胞丟失或損傷所引起的[1-3]，而通過(guò)移植類(lèi)似細(xì)胞來(lái)替代行使功能，可以達(dá)到更為有效的治療效果[4]。近年研究表明，成纖維細(xì)胞可以重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞[5]，然后分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和造血干細(xì)胞等[6-11]，也可以由成纖維直接重編程為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等[12-17]。研究者期望采用這種方式產(chǎn)生功能細(xì)胞用于移植治療多種疾病。但功能細(xì)胞的產(chǎn)生需要大量的種子細(xì)胞作支撐，由于成纖維細(xì)胞具有易獲取、易培養(yǎng)、增殖快和性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)[18-19]，因此成纖維細(xì)胞成為理想的種子細(xì)胞。成纖維細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化產(chǎn)生功能細(xì)胞后，用于自體移植可避開(kāi)免疫排斥問(wèn)題，因此成纖維細(xì)胞逐漸被視為個(gè)體化細(xì)胞移植治療疾病的首選種子細(xì)胞。本研究中，通過(guò)組織塊培養(yǎng)法分離獲得人皮膚成纖維細(xì)胞系并進(jìn)行鑒定，然后探討了成纖維細(xì)胞成脂、成骨、成軟骨和成神經(jīng)的多向分化潛能，為細(xì)胞移植修復(fù)骨損傷、軟骨損傷及神經(jīng)退行性疾病的臨床應(yīng)用提供了充足的種子細(xì)胞來(lái)源以及初步的研究依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.樣品：皮膚組織采集自健康捐獻(xiàn)者（30 ～60 歲）。捐獻(xiàn)者簽署了相關(guān)的知情同意書(shū)。該實(shí)驗(yàn)符合聊城市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的規(guī)定并得到批準(zhǔn)。

2.主要儀器：臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），熒光顯微鏡（日本尼康公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司），染色體分析系統(tǒng)（日本尼康公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

3.主要的試劑：D-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基 （美國(guó)Invitrogen公司），F(xiàn)BS （美國(guó)Sciencell公司），DMEM/F12、L-Glutamine、非必需氨基酸、胎牛血清 （FBS）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （f i broblast growth factor，bFGF）、TrypLE（美 國(guó) Invitrogen 公 司），Vimentin鼠源單克隆抗體 （上海碧云天公司），線粒體染料MitoTracker?Deep Red FM （美國(guó)Invitrogen公司），TUJ1鼠源單克隆抗體、茜素紅染料、阿利新藍(lán)染料、油紅O染料（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）。

二、方法

（一）人體成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

采集人體皮膚組織，并培養(yǎng)原代細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)符合聊城市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的規(guī)定并得到批準(zhǔn)。在局部麻醉的條件下利用電動(dòng)牙鉆，采集皮膚組織（厚2～3 mm，直徑6 mm），并放入含青霉素/鏈霉素（P/S）的無(wú)菌DMEM培養(yǎng)液中洗滌1次，再用磷酸緩沖液（DPBS）洗滌2次。漂洗完后的組織在無(wú)菌條件下先去除皮下脂肪，再用眼科剪剪成近1 mm2×1 mm2的組織塊。然后轉(zhuǎn)至25 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加入MEF培養(yǎng)基（DMEM，10%胎牛血清（FBS），1%非必需氨基酸，1%青霉素/鏈霉素（P/S）。置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)大約1～2周后，通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)組織塊周?chē)_(kāi)始爬出原代纖維細(xì)胞，待培養(yǎng)皿中的細(xì)胞整體匯合度達(dá)到85%以上時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每周傳代1次，以1 : 3的比例進(jìn)行傳代至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待4～6 d細(xì)胞匯合度再次達(dá)到85%以上即可繼續(xù)以1 : 3比例傳代。將培養(yǎng)的前5代細(xì)胞，每代都進(jìn)行凍存保存，并保留部分繼續(xù)傳代培養(yǎng)。將分離獲得的成纖維細(xì)胞株進(jìn)行編號(hào)，本研究選取編號(hào)為NCF1，NCF2兩株成纖維細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)研究。

（二）細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

1.形態(tài)學(xué)觀察：利用光學(xué)顯微鏡觀察從組織塊爬出的原代成纖維細(xì)胞及傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，拍照并記錄成細(xì)胞形態(tài)特征。

2.流式分析鑒定：選取2株分離出的成纖維細(xì)胞，利用BD FACS AriaII fl ow cytometer（BD Biosciences）進(jìn)行流式分析。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，離心機(jī)201×g離心5 min后，棄去培養(yǎng)基。加入2 ml DPBS，渦旋混勻。離心機(jī)805×g離心5 min，棄上清。加入適量DPBS，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml。取100 μl細(xì)胞懸液（1×106個(gè)細(xì)胞），轉(zhuǎn)移至流式上樣管。加入 50 μl人血清，渦旋混勻，室溫封閉15 min。然后DPBS洗滌細(xì)胞，200×g離心5 min。細(xì)胞沉淀用50 μl DPBS重懸，分別加入 2 μl相應(yīng)抗體 FITC-CD90，PE-CD73和PE-CD34，相應(yīng)同型對(duì)照抗體分別為FITC-IgG1，PE-IgG1和PE-IgG1。渦旋混勻，室溫避光孵育45 min。加入2 ml DPBS，渦旋混勻，室溫201×g離心 5 min；棄上清，加入 400 μl DPBS，渦旋混勻，上機(jī)用流式分選儀分析。

3.波形蛋白表達(dá)分析：將分離的成纖維細(xì)胞以1×105個(gè)/孔種于6孔板中，第2天更換新鮮的MEF液。第3天將細(xì)胞培養(yǎng)液去除，加入DPBS漂洗3次，用DPBS沖洗后，用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固 定 15 min。 用 含有 0.2%Triton X-100，10%正常羊血清（NGS），1×PBS封閉緩沖液進(jìn)行封閉45 min。加小鼠波形蛋白（Vimentin）抗體（一抗，1 : 500）4℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗3遍后，加入熒光標(biāo)記二抗（1 : 1 000）室溫孵育2 h。Hoechst（1 : 10 000）核染5 min，在熒光顯微鏡下觀察分析。

4.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定：利用同一細(xì)胞系第5代和第10代的成纖維細(xì)胞，按照細(xì)胞量為2×104個(gè)/ 孔，等量接種到24孔板中，每天計(jì)數(shù)3個(gè)孔，計(jì)算平均數(shù)，共計(jì)數(shù)7 d。最后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)目為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

5.線粒體染色：將細(xì)胞培養(yǎng)蓋玻片放置于24 孔板中，分離的成纖維細(xì)胞以2×104細(xì)胞/孔種于24孔板中，第2天更換新鮮的MEF液。第3天將細(xì)胞培養(yǎng)液去除，加入MitoTracker?Deep Red FM線粒體染料，避光培養(yǎng)20 min；然后DPBS漂洗3次，用冰甲醇固定5 min，PBS漂洗3次后進(jìn)行封片，在激光共聚焦顯微鏡490 nm處觀察。參考Land的線粒體統(tǒng)計(jì)方法[20]，對(duì)線粒體相對(duì)量熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行分析。

6.核型分析：取分離出的成纖維細(xì)胞種于T25中，在細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)，在處理細(xì)胞前2 h加入終濃度為0.1 μg/ml的秋水仙堿。離心：將成纖維細(xì)胞消化，收集201×g離心10 min （升降速調(diào)為零），棄上清，用DPBS洗滌沉淀1次。低滲：利用37 ℃預(yù)熱的0.075 mol/L氯化鉀溶液約8 ml處理細(xì)胞，輕輕吹打，37 ℃溫浴20 min。預(yù)固定：再加入現(xiàn)配的甲醇、冰醋酸固定液 （3 : 1）1 ml左右，輕輕混勻，室溫下10 min后201×g離心10 min，棄上清，留沉淀。固定：沿管壁緩慢加入現(xiàn)配的固定液約8 ml，輕輕混勻，靜置25 min，然后201×g離心10 min，棄上清。制片：固定液重懸細(xì)胞沉淀，冰片上滴片，然后60 ℃烘干3 h，胰酶消化，用0.85%NaCl漂洗后進(jìn)行吉姆薩染色，晾干后即可在顯微鏡下觀察。

（三）分離細(xì)胞的多向誘導(dǎo)分化

1.成骨分化：選取生長(zhǎng)狀況良好的P3代成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度到達(dá)80%～ 90%時(shí)，進(jìn)行消化、離心收集，按1×105個(gè)/孔接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待6孔板中的細(xì)胞匯合度增至75%～ 85%時(shí)，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（成分包括：DMEM，10% FBS，100 nmol/L Dexamethasone、10 mmol/L β-glycerol phosphate、50 μmol/L L-Ascorbic acid 2-phosphate、50 nmol/L Vitamin D3），誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞成骨分化。持續(xù)誘導(dǎo)3周后，除去誘導(dǎo)培養(yǎng)液，DPBS洗滌3次，然后4%甲醛固定誘導(dǎo)的細(xì)胞，利用0.1%的茜素紅（pH值為4.2）室溫孵育染色30%min，去離子水洗去染料，然后鏡檢拍照。

2.成軟骨分化：選取生長(zhǎng)狀況良好的P3代成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度到達(dá)80%～ 90%時(shí)，進(jìn)行消化、離心收集，按1×105個(gè)/孔接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待6孔板中的細(xì)胞匯合度增至75%～ 85%時(shí)，更換成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（成分包括：DMEM，10%FBS，10 ng/ml TGF-β3、50 μmol/L L-Ascorbic acid 2-phosphate、10 μg/ml insulin），誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞成骨分化。持續(xù)誘導(dǎo)3周后，除去誘導(dǎo)培養(yǎng)液，DPBS洗滌3次，然后4%甲醛固定誘導(dǎo)的細(xì)胞，阿利新藍(lán)染色20 min后，去離子水洗去染料，然后鏡檢拍照。

3.成脂分化：選取生長(zhǎng)狀況良好的P3代成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度到達(dá)80%～ 90%時(shí)，進(jìn)行消化、離心收集，按1×105個(gè)/孔接種于6 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待6孔板中的細(xì)胞匯合度增至75%～ 85%時(shí)，更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（成分包括：1 μmol/L Dexamethasone、10 μg/ml bovine insulin、60 μmol/L indomethacin、500 μmol/L 3-isobutyl-1-methylxanthine），誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞成骨分化。持續(xù)誘導(dǎo)3周后，除去誘導(dǎo)培養(yǎng)液，DPBS洗滌3次，然后4%甲醛固定誘導(dǎo)的細(xì)胞，利用油紅O染色10～20 min，用75%的乙醇洗去染料，然后鏡檢拍照。

4.成神經(jīng)分化：參考以往文獻(xiàn)[21]誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞成神經(jīng)分化，分為2階段法，共計(jì)21 d。選取生長(zhǎng)狀況良好的P3代成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度到達(dá)80%～ 90%時(shí)，進(jìn)行消化、離心收集，按1×105個(gè)/孔接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待6孔板中的細(xì)胞匯合度增至75%～ 85%時(shí)，更換成神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基[DMEM/F12：Neurobasal（1 : 1），加入 0.5%N-2，1% B-27，100 mmol/L cAMP，20 ng/ ml bFGF，P/S雙抗及小分子化合物0.5 mmol/ L VPA；3 μmol/L CHIR99021；1 μmol/L Repsox；10 μmol/L Forskolin；10 μmol/L SP600125；10 μmol/L GO6983；5 μmol/L Y-27632] 誘 導(dǎo) 培養(yǎng)8 d后改為神經(jīng)成熟培養(yǎng)基[DMEM/ F12：Neurobasal （1 : 1），加入0.5% N-2，1% B-27，100 mmol/L cAMP, 20 ng/ml bFGF，20 ng/ml BDNF，20 ng/ml GDNF，20 ng/ml NT3，P/S 雙抗及小分子化合物 3 μmol/ L CHIR99021；10 μmol/L Forskolin；1 μmol/ L Dorsomorphin]誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞成神經(jīng)分化。

持續(xù)誘導(dǎo)3周后，免疫熒光染色分析結(jié)果。除去誘導(dǎo)培養(yǎng)液，DPBS洗滌3次，4%甲醛固定細(xì)胞15 min。用含有0.2%Triton X-100，10%正常羊血清 （NGS），1×PBS封閉緩沖液進(jìn)行封閉45 min。加封閉液1 : 500稀釋神經(jīng)元標(biāo)記物TUJ1抗體（一抗）4 ℃過(guò)夜，DPBS洗3遍；用熒光標(biāo)記的二抗反應(yīng) 2 h，DPBS洗 3遍；核染料 Hoechst（1 : 1 000）染色5 min，然后在熒光顯微鏡下觀察分析誘導(dǎo)細(xì)胞神經(jīng)元標(biāo)記物的表達(dá)情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

應(yīng)用分析軟件Graphpad Prism 6.0，成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)值用表示，兩代細(xì)胞增殖速度及線料體相對(duì)量比較采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、人體皮膚成纖維細(xì)胞的分離與鑒定

1.形態(tài)學(xué)分析：通過(guò)組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)4周即可獲得原代成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行傳代及凍存。組織塊培養(yǎng)1～2周后周?chē)雅莱鲈衫w維細(xì)胞，此時(shí)原代細(xì)胞呈緊密多邊形，更外圈的細(xì)胞由于空間的擴(kuò)大，細(xì)胞伸展開(kāi)，胞體飽滿(mǎn)并呈典型梭狀或者扁平星狀，細(xì)胞核呈橢圓。細(xì)胞的活性較強(qiáng)，增殖速度較快，4～5 d進(jìn)行傳代1次，并且在凍存復(fù)蘇傳至第10代后，細(xì)胞形態(tài)仍然為典型成纖維細(xì)胞梭狀形態(tài)（圖 1）。

圖1 光學(xué)顯微鏡下分離皮膚成纖維細(xì)胞的形態(tài)（×100）

2.皮膚成纖維細(xì)胞的流式分析：分別對(duì)編號(hào)為NCF-1，NCF-2的成纖維細(xì)胞進(jìn)行了流式分析，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)來(lái)鑒定獲得的細(xì)胞系。分析結(jié)果表明成纖維細(xì)胞均表達(dá)表面標(biāo)志物CD90（NCF1，NCF2占比分別為99.9%，98.7%），CD73（NCF1，NCF2占比分別為98.2%，85.6%），但極少表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34（NCF1，NCF2占比分別為1.8%，2.6%）（圖2）。

3.Vimentin表達(dá)分析：利用成纖維細(xì)胞特異標(biāo)志物Vimentin蛋白抗體對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，分離細(xì)胞的Vimentin表達(dá)呈陽(yáng)性，統(tǒng)計(jì)結(jié)果陽(yáng)性率為100%（圖3）。

4.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析：分別測(cè)定分離細(xì)胞的P5代及經(jīng)歷凍存、傳代后P10代細(xì)胞7 d的生長(zhǎng)曲線，比較不同代次細(xì)胞間的增殖速度變化情況。生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明，P5代細(xì)胞與P10代細(xì)胞增殖速度均為正常。其中，生長(zhǎng)曲線中第0～2天為潛伏期、第3～5天指數(shù)生長(zhǎng)期、第5～7天為平臺(tái)期。數(shù)據(jù)表明，潛伏期時(shí)，第1天細(xì)胞統(tǒng)計(jì)量較接種量有所減少，原因可能是貼壁細(xì)胞在自身和環(huán)境因素影響下，增殖速度較慢，并且有極少量的細(xì)胞未貼壁。對(duì)比結(jié)果表明分離的同一株細(xì)胞系的P5代與經(jīng)歷凍存、傳代后P10代的細(xì)胞增殖速度仍無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 1.586，P= 0.1567，圖 4）。

圖2 分離皮膚成纖維細(xì)胞的流式分析

圖3 熒光顯微鏡下分離皮膚成纖維細(xì)胞鑒定（Vimentin熒光染色，×100）

圖4 分離皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析

5.細(xì)胞線粒體分析：線粒體染料對(duì)分離細(xì)胞的P5代及P10代細(xì)胞進(jìn)行染色后，激光共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，P5與P10代次的成纖維細(xì)胞的線粒體均主要分布于核周?chē)校糠志€粒體成短線狀且圍繞著核可呈現(xiàn)出基本細(xì)胞核輪廓，多數(shù)細(xì)胞呈線粒體核周分布類(lèi)型（圖5）而且線粒體相對(duì)熒光強(qiáng)度顯示在傳代前后細(xì)胞的線粒體相對(duì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =0.664，P =0.543，圖 6）。

6.核型分析：對(duì)分離細(xì)胞的P5代及P10代細(xì)胞進(jìn)行核型分析。結(jié)果表明，分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞在傳代第5代和第10代后，細(xì)胞的染色體均顯示出了G帶，并且數(shù)目為46條。提示分離的成纖維細(xì)胞P5代和P10代染色體核型均為含46條染色體正常的二倍體，數(shù)目和形態(tài)無(wú)明顯差異（圖7）。

（二）皮膚成纖維細(xì)胞的多向分化能力鑒定

1.成骨分化：利用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d后，誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)有鈣鹽沉積，胞外基質(zhì)產(chǎn)生大量的鈣結(jié)節(jié)（圖8a）。

2.成軟骨分化：利用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行阿利新藍(lán)染色，染色結(jié)果呈陽(yáng)性（圖 8b）。

3.成脂分化：利用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行成纖維細(xì)胞的成脂分化誘導(dǎo)，成脂分化誘導(dǎo)1周左右，培養(yǎng)基明顯變粘稠，21 d后，通過(guò)油紅O染色，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞能夠分化成脂肪細(xì)胞，且細(xì)胞內(nèi)含有脂滴聚集（圖 8c）。

圖5 熒光顯微鏡下皮膚成纖維細(xì)胞線粒分析（線粒體活體染色，×100）

4.成神經(jīng)誘導(dǎo)分化：將皮膚成纖維細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)7～14 d細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，變成神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)誘導(dǎo)分化21 d后，經(jīng)免疫熒光表達(dá)分析神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物TUJ1表達(dá)呈陽(yáng)性（圖8d）。

圖6 同一株人體皮膚成纖維細(xì)胞不同代次P5，P10代細(xì)胞線粒體相對(duì)熒光強(qiáng)度值

討論

2007年Yamanaka等[22]將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4轉(zhuǎn)入成體人成纖維細(xì)胞，直接將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。隨后，研究人員將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成多種細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞（包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞）、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、造血祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞等[9,23-28]，為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊前景[29]。另外，近年來(lái)建立的直接重編程新技術(shù)，利用特定轉(zhuǎn)錄因子或者小分子化合物組合誘導(dǎo)，可以將成纖維細(xì)胞直接重編程為多種細(xì)胞。獲取患者的自體成纖維細(xì)胞，在不經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞階段直接將其轉(zhuǎn)化為將來(lái)可用于自體移植患者的各種成熟細(xì)胞。這種直接重編程獲得的細(xì)胞，既可以避免異源異體細(xì)胞移植后產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)，也避開(kāi)了帶有干性細(xì)胞移植后的成瘤性問(wèn)題。以上兩種策略極大地拓展了成纖維細(xì)胞的應(yīng)用范圍，使得普通的成纖維細(xì)胞在細(xì)胞治療的臨床研究及應(yīng)用中發(fā)揮了重要的支撐作用。

本研究為了獲得生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人體皮膚成纖維細(xì)胞，在分離細(xì)胞時(shí)，將組織塊剪碎成小塊，然后加入培養(yǎng)基直接培養(yǎng)組織塊。這樣既減少對(duì)采集皮膚組織的處理時(shí)間，也避免胰酶消化組織塊時(shí)對(duì)成纖維細(xì)胞的損傷。流式分析發(fā)現(xiàn)，分離的細(xì)胞高表達(dá)CD90、CD73、極低表達(dá)CD34，這與有關(guān)文獻(xiàn)[30-32]關(guān)于成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志物的研究結(jié)果是一致的。成纖維特異性標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)呈陽(yáng)性，提示分離的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。而通過(guò)對(duì)比成纖維細(xì)胞不同代次間的增殖能力，線粒體的分布情況，染色體核型，結(jié)果表明，分離的成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)一定傳代次數(shù)后仍具有相似的增殖速度，典型線粒體核周分布類(lèi)型及數(shù)量，同時(shí)染色體數(shù)目及形態(tài)并也未發(fā)生無(wú)明顯變化。

過(guò)去研究表明成纖維細(xì)胞在特定的情況下可沿著不同的間充質(zhì)譜系分化[33]。利用分離的成纖維細(xì)胞探討了其在成骨、成軟骨、成脂、成神經(jīng)方向的分化。茜素紅染色表明部分細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后，分化為骨細(xì)胞；阿斯利藍(lán)染色呈陽(yáng)性表面部分細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后可向軟骨細(xì)胞分化，油紅O染色表明部分細(xì)胞在誘導(dǎo)后有在胞內(nèi)形成大量脂滴，提示成纖維細(xì)胞可以向脂肪細(xì)胞分化。成神經(jīng)誘導(dǎo)中，細(xì)胞形態(tài)明顯向類(lèi)神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變，且免疫熒光染色表明部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物TUJ1。

圖8 熒光顯微鏡下分離皮膚成纖維細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化后免疫熒光染色鑒定（×200）

體細(xì)胞重編程和直接重編程技術(shù)在不斷地被優(yōu)化[34-35]，但轉(zhuǎn)化效率較低，因此需要充足的起始細(xì)胞做支撐。由于成纖維細(xì)胞具有良好的增殖能力、易于培養(yǎng)、可短時(shí)間獲得大量性狀穩(wěn)定的細(xì)胞等特點(diǎn)，成纖維細(xì)胞作為重編程的起始細(xì)胞具有更加明顯的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)經(jīng)過(guò)對(duì)成纖維細(xì)胞多向分化的探討，提示成纖維細(xì)胞在細(xì)胞移植治療骨損傷，軟骨損傷及神經(jīng)退行性疾病方面具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)分離的成纖維細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)可以向成骨、成軟骨、成脂和成神經(jīng)的分化，但各方向的分化效率有待于優(yōu)化，而且誘導(dǎo)細(xì)胞的成熟度有也待于提高。未來(lái)將會(huì)繼續(xù)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，利用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合小分子誘導(dǎo)技術(shù)，來(lái)提高誘導(dǎo)分化效率和誘導(dǎo)細(xì)胞成熟度，以便發(fā)揮成纖維細(xì)胞作為細(xì)胞移植治療應(yīng)用中起始細(xì)胞的潛在價(jià)值。