張達 杜艷輝 袁芳

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMT）是生活中常見的慢性女性疾病，是子宮內膜細胞游離到子宮外的其他地方并依附生長的現象[1]。全世界平均每年新增幾千萬子宮內膜異位患者，且不斷呈上升趨勢[2]。子宮內膜異位多出現在年輕女性人群中，隨著雌激素的減少，該病會逐漸好轉，直至消失。子宮內膜異位臨床表現多樣，通常有月經不規(guī)則、經期疼痛等癥狀。甚至會影響女性生育，造成不孕不育，研究顯示，五成左右的不孕不育患者合并該病癥[3]。目前，認為腹腔鏡手術可明確改善患者的不良情況，減輕子宮內膜異位癥給患者帶來的心理壓力及不良情緒[4]。Th17及調節(jié)性T細胞（Treg）細胞是兩種重要的CD4+效應T細胞，淋巴介導的細胞免疫是人體免疫的重要步驟，與自身免疫關系密切[8]。Th17及Treg能分泌參與人體各項機能反應的炎性因子，其中Th17分泌IL-17、IL-22等，Treg分泌IL-10、TGF-β等[9]。Th17及Treg不僅通過分泌炎性因子參與機體適應性免疫反應，還通過其特異轉錄因子參與人體各項活動，Th17特異轉錄因子為ROR-γt，Treg特異轉錄因子為FoxP3。在人體中，Treg的異常表達能誘導免疫性疾病的發(fā)生[10]。研究表明，Treg在多種腫瘤中數量增多，Treg的過表達會降低腫瘤患者的生存率[11]。子宮內膜異位患者出現Treg功能紊亂，因此，本篇文章通過流式細胞儀、HE染色法、qRT-PCR法、ELISA法分析EMT組和NM組患者Th17、Treg細胞所占比例、子宮內膜組織病變情況、ROR-γt、Foxp3 mRNA表達含量的差異性來探究腹腔鏡手術與子宮內膜異位者體內Th17、Treg細胞的關系。

資料與方法

一、資料

1.一般資料：選取2017年1月至2018年12月青島大學附屬醫(yī)院收治的子宮內膜異位癥患者 56 例，為子宮內膜異位組（EMT 組），年齡 21 ～40 （29.68±3.68）歲。選取同一時期在醫(yī)院因不孕不育進行腹腔鏡檢查的患者56例，為正常組（NM組），年齡20～39 （30.69±4.85）歲。EMT組和NM組患者在一般資料上無差異。此次實驗符合醫(yī)院倫理委員會批準（批件號：18-126/1709）。

2.納入和排除標準：納入標準：（1）月經規(guī)律；（2）術前3個月未進行其他方式治療子宮內膜異位癥；（3）未患有其他重大疾病。排除標準：（1）有痛經史及月經異常史；（2）調查期間無故退出活動；（3）臨床資料收集不完整。

3.實驗儀器及試劑：ELISA試劑盒（美國R&D systems公司）；染色緩沖液（美國BD Pharmingen 公司）；恒溫搖床（成都蘇凈器材公司）。

二、方法

1.流式細胞儀檢測Th17、Treg細胞比例：采集患者外周肘靜脈血3 ml，加入T細胞抗人抗體10 μl，孵育 20 min，溶解紅細胞，固定，加 IL-17、Treg 抗體 10 μl，孵育 50 min，洗滌，重懸，檢測比例。

2.檢測EMT組和NM組患者血清中炎性因子水平：采用ELISA法檢測EMT組和NM組患者血清中 IL-17、TGF-β、IL-22、IL-10的水平，本實驗要求在2 min內完成并取平均值。

3.HE染色法檢測子宮內膜組織病變情況：腹腔鏡術中取EMT組、NM組患者子宮內膜組織。取出的內膜組織固定15 min,將內膜組織用石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，用山羊血清進行封閉處理，蘇木精和伊紅染色液復染分別為6～8 min和10 s，顯微鏡下觀察異位內膜組織形態(tài)。

4.qRT-PCR法檢測子宮內膜組織中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表達含量：在子宮內膜組織中加入氯仿，搖蕩，離心，使溶液呈乳白狀，4 ℃ 1 200×g離心10 min，加異丙醇，離心，加75%乙醇離心，干燥，-80℃保存。反轉錄體系：94℃15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 10 min，重復 40 次反轉錄體系。最后計算。（表1）

三、統計學分析方法

采用SPSS 22.0進行統計分析，通過觀察EMT組和NM組患者的子宮內膜組織病變情況、炎性因子、子宮內膜組織中 ROR-γt、Foxp3 mRNA 表達含量用表示，組間差異采用獨立t檢驗，以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

表1 引物序列

結果

一、流式細胞儀檢測Th17、Treg細胞所占比例

EMT組和NM組相比較，EMT組Th17所占比例比NM組高，EMT組患者Treg所占比例比NM組低，差異有統計學意義（t= 7.869，3.015，P=0.014，0.026）。（圖 1，表2）

圖1 EMT組和NM組Th17、Treg細胞所占比例

表2 EMT組和NM組患者Th17、Treg細胞所占比例（± s）

表2 EMT組和NM組患者Th17、Treg細胞所占比例（± s）

分組 例數 Th17細胞 Treg細胞EMT 組 56 5.48±2.81 4.22±1.04 NM組 56 2.34±1.01 6.14±1.52 t 值 7.869 3.015 P值 0.014 0.026

二、EMT組和NM組患者血清中Th17分泌IL- 17、IL-22水平

結果顯示，EMT組和NM組相比較，EMT組IL- 17、IL-22均比NM組高，差異有統計學意義 （t=9.944，4.689，P= 0.008，0.017。（圖 2，表3）

圖2 EMT組和NM組血清中IL-17、IL-22水平比較

表3 EMT組和NM組患者血清中Th17分泌IL-17、IL-22水平比較（pg/ml，± s）

表3 EMT組和NM組患者血清中Th17分泌IL-17、IL-22水平比較（pg/ml，± s）

分組 例數 IL-17 IL-22 EMT 組 56 256.38±34.15 67.48±10.89 NM組 56 198.04±27.59 43.78± 6.92 t 值 9.944 4.689 P值 0.008 0.017

三、EMT組和NM組患者血清中Treg分泌IL- 10、TGF-β 水平

結果顯示，EMT組和NM組相比較，EMT組IL-10比NM組低，TGF-β比NM組高，差異有統計學意義（t= 9.491，2.849，P= 0.012，0.034。（圖 3，表4）

表4 EMT組和NM組患者血清中Treg分泌IL-10、TGF-β水平比較（pg/ml，± s）

表4 EMT組和NM組患者血清中Treg分泌IL-10、TGF-β水平比較（pg/ml，± s）

分組 例數 IL-10 TGF-β EMT 組 56 18.56±4.77 148.28±40.52 NM組 56 28.35±6.07 204.78±19.87 t 值 9.491 2.849 P值 0.012 0.034

圖3 EMT組和NM組血清中IL-10、TGF-β水平比較

四、HE染色法檢測子宮內膜組織病變情況

由圖可知，EMT組患者子宮內膜組織形態(tài)不規(guī)則，多數細胞不完整，破損或缺失，且炎性細胞增多，在其周圍聚集。NM組患者子宮內膜組織形態(tài)規(guī)則，細胞沒有明顯破損或缺失，未見細胞周圍炎性因子增多（圖 4）。

五、qRT-PCR法檢測子宮內膜組織中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表達含量

qRT-PCR檢測結果顯示，EMT組Foxp3 mRNA的表達含量比NM組低，差異有統計學意義（t= 10.996，6.759，P= 0.006，0.011）。（圖 5，表5）。

表5 EMT組和NM組患者子宮內膜組織中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表達含量（± s）

表5 EMT組和NM組患者子宮內膜組織中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表達含量（± s）

分組 例數 ROR-γ mRNA Foxp3 mRNA EMT 組 56 2.89±0.76 2.25±0.34 NM組 56 1.71±0.26 1.13±0.18 t 值 10.996 6.759 P值 0.006 0.011

討論

子宮內膜異位癥為子宮內膜細胞游離到子宮外的其他地方并依附生長的現象[12]。子宮內膜異位多發(fā)生在患者的卵巢、直腸等離子宮較近的部位。在病理組織學中，該病屬于良性范圍，但同時有增殖、遷移等轉移癥狀，應予以重視[13]。該病對患者的生活造成較大的影響，因此，需要盡早進行診斷與治療。子宮內膜異位癥由于存在個體差異且形態(tài)多種多樣，因此，術中正確的分辨病灶對于手術切除效率有重要影響。

圖4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察EMT組和NM組子宮內膜組織病變情況（HE染色，×400）

圖5 EMT組和NM組子宮內膜組織中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表達含量

本文研究結果顯示，EMT組和NM組相比較，EMT組患者體內血清Th17所占比例、炎性因子水平高于NM組，但Treg比例卻與Th17相反。qRT- PCR檢測結果顯示，ROR-γ mRNA EMT組比NM組高，Foxp3 mRNA EMT組比NM組低。同時，通過染色觀察到EMT組患者子宮內膜組織形態(tài)不規(guī)則，多數細胞不完整，破損或缺失，NM組患者子宮內膜組織形態(tài)規(guī)則，細胞沒有明顯破損或缺失。研究顯示，在人體中，Th17、Treg細胞是CD4+T淋巴細胞中的2個主要因子，他們在人體內部的所有生理反應中都占有重要地位，同時也是腫瘤發(fā)生過程中、炎性因子形成中的重要參與因子[15]。其中，Th17細胞發(fā)揮生理作用主要是通過分泌IL-17、IL-22應對人體中出現的機理病變。Treg細胞發(fā)揮生理作用主要是通過分泌IL-10、TGF-β等抑制性細胞因子，在人體的免疫系統及炎癥反應中占重要地位[16]。體外實驗證實，當有病原入侵或自身有炎癥時，人體免疫系統就將Treg細胞聚集到病灶處，用于消滅或清除病灶或炎癥，同時，促炎因子通過上調內膜間質細胞進一步聚集Th17細胞，Th17細胞增多能夠促進子宮內膜異位癥病情的進一步發(fā)展，加重患者的癥狀[17]。外國學者研究證實，內異癥患者腹腔液中存在大量的Th17細胞，該細胞能夠快速促進內膜病變組織的增殖、遷移，從而使患者病情加重，促進病情發(fā)展[18]。通過病例對照的方法，相關學者研究發(fā)現，患有子宮內膜異位癥的患者其自身的Treg細胞分布雜亂無章[19]。其患者的腹腔液中及血清中Treg細胞出現不同，患者腹腔液中Treg分泌細胞因子濃度明顯升高，從而進一步誘導炎癥級聯反應。因此，Th17、Treg在子宮內膜異位癥中發(fā)揮重要作用，它們之間相互影響，可作為判斷機體細胞免疫能力的指標[20]。本篇文章所得結果與上述學者研究一致。

綜上所述，子宮內膜異位癥患者外周血免疫調節(jié)細胞Th17/Treg平衡失調，免疫調節(jié)紊亂與子宮內膜異位發(fā)生、發(fā)展有密切關系。