白家赫，于永鵬，劉麗君，鄭亞利，李鑫，譚蘭

腦微出血（cerebral microbleeds，CMBs）是以微小出血為主要特征的一種腦小血管病變[1]。不同類型的卒中患者CMBs的發(fā)生率波動在19.4%～68.5%[2]。腦出血患者CMBs的發(fā)生率為38%～66%，腦梗死患者為21%～26%，而在健康人群為5%～6%。CMBs是急性腦梗死后發(fā)生出血轉(zhuǎn)化的獨立危險因素，也是腦梗死患者接受溶栓、抗凝藥物治療發(fā)生癥狀性出血轉(zhuǎn)化的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路能抑制腦梗死患者接受rt-PA溶栓治療的出血轉(zhuǎn)化[3]。VEGF與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9過表達在腦轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)性顱內(nèi)出血中發(fā)揮促進作用[4]。VEGF增高是急性腦梗死患者CMBs發(fā)生的獨立危險因素，VEGF水平與CMBs嚴重程度相關(guān)[5-6]。推測VEGF可能參與CMBs的起始和進展過程。

目前認為基因遺傳因素參與了包括CMBs在內(nèi)的腦小血管病的發(fā)生、發(fā)展過程[7-8]。在遺傳基因方面，載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）ε4等位基因是迄今唯一較公認的增加CMBs發(fā)生風(fēng)險的遺傳因素[2，9-10]。針對我國漢族人群ApoE基因型與CMBs的相關(guān)性研究尚未見報道，ApoE基因型是否與潛在的CMBs風(fēng)險因子存在交互作用，目前仍不清楚。雖然近期有研究針對漢族人群探討了急性腦梗死患者CMBs與VEGF相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)VEGF水平與CMBs嚴重程度相關(guān)[10]。也有研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）患者血清VEGF水平與CMBs存在相關(guān)性[11]。上述研究均未對ApoE基因進行分型，VEGF水平與ApoE基因型是否存在交互作用，仍不清楚。因此，本研究選取急性腦梗死患者為研究對象，基于ApoE基因分型和CMBs影像學(xué)分類，探討漢族人群血漿VEGF水平與CMBs及其影像學(xué)分類的關(guān)系，為CMBs預(yù)警篩查提供有效的生物標志物。

1 研究對象及方法

1.1 研究對象 研究所選擇的對象來自于2014年8月-2017年8月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院黃島分院及青島大學(xué)附屬威海市中心醫(yī)院住院治療的急性腦梗死患者。納入標準：①所有病例診斷符合中國急性期缺血性腦卒中診治指南2010版的標準，經(jīng)顱腦MRI證實為新發(fā)梗死（DWI序列高信號和表觀彌散系數(shù)低信號）[12]；②發(fā)病48 h內(nèi)入院；③18歲≤年齡≤80歲。排除標準：①合并顱內(nèi)出血、腦外傷、腦梗死后出血轉(zhuǎn)化、感染及腫瘤等占位性病變；②伴嚴重的心、肝、腎等基礎(chǔ)疾病；③年齡＞80歲，伴嚴重癡呆、帕金森病或帕金森綜合征；④伴神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病如吉蘭-巴雷綜合征、多發(fā)性硬化等；⑤意識障礙。

1.2 方法 對所有患者進行MRI（包括T1WI，T2WI，DWI及SWI等序列）檢查。常規(guī)行心電圖、心臟彩超、頸部動脈彩超、顱腦MRA（或CTA）及TCD等檢查，病因分型參照TOAST分型標準。記錄危險因素：年齡、性別、吸煙、飲酒、簡易精神狀態(tài)評估量表（mini-mental state examination，MMSE）評分、NIHSS評分、高血壓病、收縮壓水平、糖尿病、高血脂、抗高血壓、抗凝及抗血小板藥物使用等。本研究已經(jīng)通過青島大學(xué)倫理委員會批準。

主要協(xié)變量的定義：①高血壓?。翰∏皯?yīng)用降壓藥物，入院時收縮壓≥140 mm Hg和（或）舒張壓≥90 mm Hg；②糖尿?。禾悄虿〔∈罚豢崭寡恰?.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L合并糖化血紅蛋白≥6.5%；③高脂血癥：既往有血脂異常或入院檢查血脂異常，TC＞5.72 mmol/L，TG＞1.72 mmol/L，或LDL＞3.12 mmol/L；④吸煙：目前仍吸煙或已戒煙（10支/天，持續(xù)5年以上）；⑤飲酒：飲酒量＞50 mL/d，戒酒或未戒酒。

1.2.1ApoE基因分型及血管內(nèi)皮生長因子檢測 所有患者在入院24 h內(nèi)（即發(fā)病72 h內(nèi)）抽取空腹靜脈血10 mL。其中5 mL血用于血糖、血脂、血常規(guī)、血凝常規(guī)等檢測。另5 mL血采用人VEGF Quantikine ELISA試劑盒檢測血漿VEGF水平。VEGF操作步驟按照說明書進行。ApoE基因分型采用的引物由南京東極生物科技有限公司設(shè)計并提供。使用以下引物進行擴增。ApoE rs429358：5’-TGTCCAAGGAGCTGCAGG-3’和5’-CTGCCCATCTCCTCCATCC-3’（片段長度3 9 3 b p）；Ap o Er s7412：5’-ATGCCGATGACCTGCAGAA-3’和5’-CTGCCCATCTCCTCCATCC-3’（片段長度219 bp）。具體操作步驟按照說明書進行。

1.2.2 腦微出血MRI檢測及其影像學(xué)分類 采用GE公司的超導(dǎo)性磁共振成像系統(tǒng)（型號：GE MR Discovery 750 3.0T）、先后獲得橫軸位T1WI及T2WI、矢狀位T1WI、DWI、3D-TOF MRA和SWI圖像。掃描參數(shù)為：FLAIRT1WI[重復(fù)時間（repetition time，TR）/回波時間（echo time，TE），1750 ms/24 ms，反轉(zhuǎn)時間（inversion time，TI）780 ms；視野24 cm×24 cm，矩陣320×256]；快速恢復(fù)快速自旋回波（fast relaxation fast spin echo，F(xiàn)RFSE）-T2WI（TR/TE，4300 ms/95 ms，視野24 cm×24 cm，矩陣512×512）；DWI-平面回波成像（echo planar imaging，EPI）（TR/TE，3000 ms/70 ms；視野24 cm×24 cm，矩陣160×160。其中SWI序列參數(shù)為：3D T1-快速場回波（fast field echo，F(xiàn)FE），TR Minimum，TE 45.0 ms，反轉(zhuǎn)角15°，層厚2 mm，無間隔采集，矩陣384×320，激勵次數(shù)1.0?；颊呷朐汉笮蠱RI平掃+SWI。CMBs診斷標準為SWI序列上圓形或橢圓形、質(zhì)地均一、直徑為2～10 mm低信號影，邊界清楚、周圍無水腫，并排除顱內(nèi)鈣化、鐵沉積、海綿狀血管瘤及擴大的血管周圍間隙等[13]（圖1）。根據(jù)CMBs的分布位置不同，參照CMBs解剖評定量表可分為深部CMBs（基底節(jié)、丘腦、內(nèi)囊、外囊及胼胝體和腦室周圍白質(zhì)）、腦葉CMBs（皮質(zhì)和皮質(zhì)下白質(zhì)）、幕下CMBs（腦干及小腦）、混合型CMBs（腦葉+深部或幕下+腦葉），為方便研究，本研究將幕下CMBs歸類于深部CMBs。為避免混合型CMBs對研究的干擾，予以剔除。所有MRI圖像均由2名影像專業(yè)醫(yī)師分別閱片給出報告。

圖1 腦微出血在SWI序列上的表現(xiàn)

1.2.3ApoE基因分型依據(jù) 鑒于ApoEε4與Ap oEε2等位基因與腦內(nèi)出血高風(fēng)險、CMBs及白質(zhì)高信號（white matter hyperintensities，WMH）負荷增加有關(guān)。且ApoE不同的基因型可能影響CMBs的不同影像學(xué)分類。因此本研究參照既往研究中ApoE基因分型思路，根據(jù)ApoE基因型對CMBs的影響不同，分為兩類：攜帶ε2或ε4等位基因（ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4、ε4/ε4）和僅攜帶ε3/ε3等位基因[14]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，正態(tài)分布計量資料以表示，計數(shù)資料用頻數(shù)（%）表示。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。計數(shù)資料兩樣本間比較采用卡方檢驗。使用Logistic分析校正混雜因素，分析VEGF與總體CMBs及CMBs不同影像學(xué)分類的關(guān)系。不同的回歸分析模型采用不同的協(xié)變量（年齡、性別、MMSE評分、NIHSS評分、高血壓病、收縮壓水平、糖尿病、吸煙、飲酒及抗血小板藥、抗凝劑、他汀類藥物使用等）進行校正。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的人口統(tǒng)計學(xué)和臨床特征 本研究共納入451例腦梗死患者，經(jīng)篩查發(fā)現(xiàn)CMBs 99例，將混合型分布（腦葉+深部或幕下+腦葉）CMBs 7例予以剔除。實際CMBs組92例，CMBs組的MMSE評分較非CMBs組低，CMBs組患者認知功能明顯受損（表1）。本研究并未發(fā)現(xiàn)ApoEε2和ε4兩個等位基因在腦葉和腦深部CMBs個體中的分布存在差異（P＞0.05）。與非CMBs患者比較，合并CMBs的腦梗死人群中有更高的ApoEε2或ε4等位基因攜帶率（P＜0.05）。CMBs組患者存在高血壓的比例較非CMBs組高（χ2=68.12，P=0.00），其他因素包括年齡、性別、MMSE評分、NIHSS評分、收縮壓水平、糖尿病、吸煙、飲酒及抗血小板藥、抗凝劑、他汀類藥物使用等，各組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 研究對象的人口統(tǒng)計學(xué)和臨床特征

2.2 血管內(nèi)皮生長因子與CMBs的關(guān)系及其交互作用 CMBs組血漿VEGF水平高于非CMBs組（P=0.005），基于CMBs不同影像學(xué)分類亞組分析，腦深部CMBs組血漿VEGF水平高于非CMBs組（P=0.009）（圖2）。Logistic回歸分析表明，高水平血漿VEGF是CMBs的風(fēng)險因素（OR1.59，95%CI1.02～2.47，P=0.005）。在腦深部CMBs患者中，血漿VEGF水平與ApoE基因型存在交互作用（P=0.01）。在攜帶ApoEε3/ε3患者中，血漿VEGF水平每增加一個標準差對于腦深部CMBs的多因素校正OR值是0.90（95%CI0.49～1.20，P=0.73）；在ApoEε2或ε4患者中，對腦深部CMBs多因素校正OR值是2.83（95%CI1.31～6.10，P=0.008）（圖3）。

圖2 CMBs組與非CMBs組及CMBs各亞組患者血漿VEGF水平的比較

圖3 CMBs中ApoE基因型與血漿VEGF間交互作用分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在腦梗死人群中CMBs患病率為22.0%（99/451），多數(shù)患者存在單發(fā)CMBs，其中多發(fā)CMBs者42例，CMBs的位置分布較為廣泛，21例多發(fā)CMBs分布在腦葉，14例分布于基底節(jié)、丘腦、內(nèi)外囊、胼胝體和腦室周圍白質(zhì)、腦干及小腦等區(qū)域，7例多發(fā)CMBs屬于混合型分布（腦葉+深部或幕下+腦葉），為避免對研究的干擾，予以剔除。本研究觀察到男性CMBs患病率較女性高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與本研究中男性樣本年齡偏大有關(guān)。既往研究表明藥物使用情況影響CMBs的發(fā)生，故本研究將藥物使用情況進行了統(tǒng)計分析[15-16]。

3.1ApoE基因型與CMBs的關(guān)系A(chǔ)poE在腦功能中發(fā)揮多種作用，改變腦血管疾病和癡呆對常見危險因素的反應(yīng)，影響其發(fā)生風(fēng)險及易感性。例如，ApoE等位基因狀態(tài)與WMH（缺血性小血管疾病的標志）相關(guān)。ApoEε4與腦深部WMH有關(guān)[17]。攜帶ApoEε2或ε4等位基因的個體表現(xiàn)出更高的腦葉出血風(fēng)險[16，18]。ApoEε4等位基因與深部和腦葉出血有關(guān)，而ApoEε2等位基因與腦深部出血的風(fēng)險增加有關(guān)[19]。提示腦出血的分布類型及其發(fā)生易感性可能具有ApoE等位基因風(fēng)險依賴性。然而在漢族人群中，ApoE等位基因與CMBs的影像學(xué)分類是否存在關(guān)聯(lián)，目前尚不清楚。有證據(jù)提示ε4等位基因可能對腦葉CMBs有更強的影響[16]。有一項包含了42個研究（共29 965例）的系統(tǒng)回顧和Meta分析表明，ApoEε4和ApoE ε2基因型與WMH負荷增加相關(guān)，ApoE4基因型與CMBs特別是腦葉CMBs發(fā)病率增加有關(guān)，而ApoEε2基因型與腦梗死相關(guān)[20]。本研究并未發(fā)現(xiàn)攜帶ApoEε2或ε4的等位基因在腦葉和腦深部CMBs個體中的分布存在差異（P=0.826）。與非CMBs患者比較，合并CMBs的腦梗死人群中有更高的ApoEε2或ε4等位基因攜帶率（P=0.01）。這一點與既往研究結(jié)果不盡一致，分析原因認為，不同種族人群CMBs的分布對ApoEε2或ε4基因型的風(fēng)險依賴可能存在差異。另外，本研究選取急性腦梗死人群為研究對象，不除外腦梗死急性期病理過程導(dǎo)致新發(fā)CMBs的可能，因此可能對分析ApoE基因型與CMBs的風(fēng)險關(guān)系產(chǎn)生偏倚。

3.2 CMBs影像學(xué)分類與炎性標志物的關(guān)系 CMBs不同影像學(xué)類型可能預(yù)示著不同的發(fā)生機制。上面的論述也表明CMBs影像學(xué)類型及其發(fā)生易感性可能具有ApoE等位基因風(fēng)險依賴性。既往有研究發(fā)現(xiàn)，較高水平的血清炎性標志物（CRP、IL-6和IL-18）與腦深部和腦葉CMBs相關(guān)[21]。VEGF具有強烈的促內(nèi)皮細胞增殖及促進新生血管形成的作用，可使血管通透性增加血漿蛋白滲出，在整合素及基質(zhì)的作用下誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、遷移，形成新生血管[22]。當前關(guān)于CMBs的發(fā)生機制尚未明確，血腦屏障受損是CMBs主要的發(fā)生機制假說之一[23]。作為CMBs的兩個常見病因，高血壓和腦淀粉樣血管病變均可導(dǎo)致血腦屏障的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)腦血管淀粉樣變性（cerebral amyloid angiopathy，CAA）患者中β-淀粉樣蛋白的沉積可導(dǎo)致血腦屏障通透性增加及MMP-2、MMP-9表達增加。VEGF、血管生成素、MMP是促進新生血管形成的主要細胞因子，在促進血腦屏障通透性增加中發(fā)揮重要作用。近期國內(nèi)研究報道AD患者血清VEGF水平與CMBs存在相關(guān)性[14]。

在漢族人群ApoE基因分型背景下，CMBs影像學(xué)分類與血漿VEGF是否存在相關(guān)性，至今仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在整體CMBs層面，與CMBs有關(guān)的是血漿VEGF水平。基于不同CMBs影像學(xué)分類亞組分析發(fā)現(xiàn)血漿VEGF能增加CMBs的風(fēng)險。既往研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死合并CMBs患者血清VEGF水平大約是健康人的4倍[24]。近期有研究發(fā)現(xiàn)VEGF增高是急性腦梗死患者CMBs發(fā)生的獨立危險因素，VEGF水平與CMBs嚴重程度相關(guān)[6]。本研究關(guān)于血漿VEGF水平與CMBs關(guān)系的結(jié)果與上述研究一致。上述研究納入的研究對象是發(fā)病24 h內(nèi)的腦梗死患者，且采集血樣的時間在發(fā)病24 h內(nèi)，不除外腦梗死超急性期及急性期病理過程對血漿VEGF等檢測指標的影響。而本研究納入的研究對象是發(fā)病48 h的腦梗死患者，且在患者入院第2日的清晨采集血樣標本，即患者發(fā)病72 h內(nèi)采集血樣，盡可能減少上述因素所造成的偏倚。本研究發(fā)現(xiàn)腦深部CMBs與高水平血漿VEGF有關(guān)。在ApoEε2或ε4患者中，高水平血漿VEGF是腦深部CMBs的風(fēng)險因素（OR2.83，95%CI1.31～6.10，P=0.008）。提示血漿VEGF在不同CMBs影像學(xué)分類亞組與ApoE基因型存在一定的交互作用。這是本研究的創(chuàng)新之處，進一步發(fā)現(xiàn)ApoE基因型與血漿VEGF參與CMBs發(fā)生易感性風(fēng)險控制的復(fù)雜性。ApoE等位基因型不同狀態(tài)對血漿VEGF與CMBs不同影像學(xué)類型風(fēng)險關(guān)聯(lián)的影響可能由不同的機制介導(dǎo)。

3.3ApoE基因型對血漿VEGF與CMBs風(fēng)險關(guān)聯(lián)的影響及其可能機制 眾多研究發(fā)現(xiàn)，ApoE是脂蛋白代謝過程中一個重要的調(diào)節(jié)劑，是心腦血管疾病、AD等慢性疾病重要風(fēng)險因素之一。ApoE4可能涉及到對線粒體功能的異常調(diào)節(jié)，與缺血性腦損傷后的惡化結(jié)局有關(guān)[25]。ApoE基因型與氧化/氮化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控、線粒體功能和炎癥反應(yīng)存在密切的聯(lián)系。ApoE蛋白的多功能特性及基因型對疾病風(fēng)險的影響在很大程度上可能歸因于對氧化/氮化應(yīng)激狀態(tài)的影響或基于ApoE免疫細胞/抗炎特性的影響。

已有大量研究證實了ApoE基因型與氧化應(yīng)激和衰老過程之間的關(guān)聯(lián)。ApoE異構(gòu)體特異性抗氧化能力的順序是ApoE2＞ApoE3＞ApoE4。ApoE4與氧化應(yīng)激標志物呈正相關(guān)，ApoEε4/ε3雜合子個體中脂質(zhì)過氧化物水平升高[26-27]。ApoEε4等位基因?qū)е赂叩难趸瘧?yīng)激和促炎狀態(tài)[28-29]。在ApoE ε4攜帶者中發(fā)現(xiàn)了高水平的氧化/氮化應(yīng)激壓力，這可能是ApoEε4和人類疾病之間基因關(guān)聯(lián)的潛在機制之一[30]。研究發(fā)現(xiàn)，ApoE基因多態(tài)性通過對細胞內(nèi)鈣水平調(diào)節(jié)影響神經(jīng)元細胞凋亡，所有ApoEε4等位基因型，即ε2/ε4、ε3/ε4和ε4/ε4與AD風(fēng)險增加相關(guān)，而ApoE ε2/ε2、ε2/ε3和ε3/ε3則具有保護作用[31]。提示ApoE基因多態(tài)性對疾病狀態(tài)影響的復(fù)雜性和多樣性。即ApoE不同基因型對氧化應(yīng)激等生化病理狀態(tài)影響是不同的，從而對疾病的發(fā)生易感性產(chǎn)生不同的影響[28，32-33]。ApoEε4通過調(diào)節(jié)炎性分子即增加IL-1和減少IL-10表達水平來調(diào)節(jié)MMP-9和組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）-1的水平[34]。而MMP是參與合成和降解細胞外基質(zhì)和具有特定底物的酶，涉及MMP在細胞外基質(zhì)的重塑。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)MMP-9水平有助于清除β-淀粉樣蛋白，MMP-9與CMBs密切相關(guān)[35-36]。新生血管形成反應(yīng)存在VEGF、CD31、MMP-2、MMP-9上調(diào)和TIMP-1和TIMP-2下調(diào)等主要特征，伴有MMP蛋白水解活性增強、血管Ⅳ型膠原和層粘連蛋白的降解，VEGF是血管炎癥發(fā)生過程中重要的趨化因子[37-39]。VEGF和MMP都至少部分受到氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)，這一病理過程與CMBs是密切相關(guān)的。在一定程度上，VEGF和ApoE蛋白的表達可能受ApoEε4基因型調(diào)控[40]。不同亞型的ApoE對包括VEGF在內(nèi)的細胞因子的調(diào)控發(fā)揮的作用不同[41]。由于VEGF表達受缺氧、氧化應(yīng)激和氮化應(yīng)激等因素調(diào)控，推測ApoE不同基因型影響VEGF參與CMBs的機制，可能是通過調(diào)控氧化或氮化應(yīng)激等炎性機制影響VEGF的表達，從而參與內(nèi)皮細胞功能的調(diào)節(jié)。

本研究結(jié)果表明，ApoE基因型可能對CMBs發(fā)生風(fēng)險相關(guān)炎性細胞因子，例如血管內(nèi)皮細胞調(diào)節(jié)因子VEGF致病風(fēng)險產(chǎn)生修飾作用。在遺傳基因方面，ApoE基因型可能是唯一增加CMBs發(fā)生風(fēng)險的敏感性因素。然而ApoE基因型方法在診斷CMBs方面的能力是有限的。因此，結(jié)合易感基因分型策略，聯(lián)合其他體液生物標志物進行評估，可能是進行CMBs早期篩查診斷的有效手段。在整體CMBs層面，血漿VEGF水平與CMBs有關(guān)。血漿VEGF在不同的CMBs影像學(xué)分類亞組與ApoE基因型存在交互作用。本研究結(jié)果提示ApoE基因型狀態(tài)可能影響血漿VEGF與CMBs發(fā)生風(fēng)險及其影像學(xué)分類的內(nèi)在聯(lián)系，即血漿VEGF對CMBs風(fēng)險作用可能存在ApoE基因型依賴。尤其是那些攜帶ε2或ε4等位基因者，對血漿VEGF的綜合評價可能有助于CMBs的早期診斷和預(yù)測。

本研究仍存在一些局限性：①屬于橫斷面研究，僅在單個時間點進行MRI評估和VEGF檢測。尚不清楚急性腦梗死的病程是否會對患者血清VEGF產(chǎn)生影響。為了盡可能減少非同期評估及急性腦梗死病程等混雜因素對研究結(jié)果的影響，在患者發(fā)病后的72 h內(nèi)完成頭顱MRI并采集血、尿相關(guān)樣本并保存進行檢測；②本研究采用漢族人群為研究對象，鑒于不同種族的差異性，本研究結(jié)果不能推廣到其他種族人群。是否存在其他未知的影響ApoE基因型/CMBs風(fēng)險關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)因子，仍不清楚，需要將來進一步研究。

【點睛】基于載脂蛋白E基因分型研究發(fā)現(xiàn)腦深部腦微出血與高水平血漿血管內(nèi)皮生長因子有關(guān)。血漿血管內(nèi)皮生長因子與腦微出血的風(fēng)險聯(lián)系可能存在載脂蛋白E基因型依賴。