李昊天,裴效瑞,李洪濤,郝明利

李昊天,裴效瑞,李洪濤,郝明利,天津市泰達醫(yī)院普外科 天津市300457

核心提要：長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,LncRNA)在腫瘤中可能發(fā)揮抑癌或促癌作用,LncRNA SNHG14在腫瘤中發(fā)揮癌基因作用,但其在胃癌發(fā)生過程中的分子機制尚未完全闡明.本研究擬尋找LncRNA SNHG14下游調(diào)控基因,并探討其可能作用機制,為揭示LncRNA SNHG14在胃癌中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新方向.

0 引言

胃癌屬于消化道惡性腫瘤之一,我國胃癌發(fā)病率較高,但胃癌發(fā)病機制尚未完全闡明,研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)表達異常與胃癌等多種惡性腫瘤有關(guān)[1].因而積極探尋新型LncRNA為揭示胃癌發(fā)病機制提供新方向.研究表明[2]LncRNA SNHG14可促進胃癌細胞增殖、抑制細胞凋亡.SNHG14可促進結(jié)腸癌、卵巢癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移[3,4].starBase預(yù)測顯示微小RNA-144-3p(microRNA-144-3p,miR-144-3p)可能是SNHG14的靶基因,研究表明miR-144-3p可抑制胃癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移[5].研究表明miR-144-3p可抑制肺癌、前列腺癌細胞增殖、侵襲[6,7].但SNHG14是否可通過調(diào)控miR-144-3p表達從而參與胃癌細胞增殖及凋亡過程尚未可知.因此,本研究主要探討SNHG14對胃癌細胞增殖及凋亡的影響并分析其是否通過靶向下調(diào)miR-144-3p而發(fā)揮作用.

1 材料和方法

1.1 材料 人胃黏膜上皮正常細胞系GES-1與胃癌細胞MKN-45、BGC-823、MGC-803、HGC-27均購自美國ATCC公司.RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素及鏈霉素均購自美國Gibco公司； SNHG14小干擾RNA(si-SNHG14)及無意義陰性對照序列(sicon)、miR-144-3p抑制劑(anti-miR-144-3p)及其陰性對照(anti-miR-con)均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000與Trizol均購自美國Invitrogen公司； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Green熒光染料均購自美國Thermo Fisher公司； 甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購自武漢艾美捷科技有限公司； 細胞凋亡檢測試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司； RIPA蛋白裂解液購自美國Sigma公司； 細胞周期蛋白1(cyclin D1)、B淋巴細胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、p21、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)單克隆抗體均購自美國Abcam公司； 磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)及其磷酸化蛋白(p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)及其磷酸化蛋白(p-AKT)抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司； 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組：GES-1、MKN-45、BGC-823、MGC-803、HGC-27細胞置于37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)溶解,放入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng),待細胞生長融合至60%左右時傳代培養(yǎng).取對數(shù)生長期胃癌MGC-803細胞,0.25%胰蛋白酶消化,制備單細胞懸液接種至24孔板(5×103個/mL),細胞隨機分成未經(jīng)任何處理的細胞(NC)組、陰性對照(si-con)組、SNHG14小干擾RNA(si-SNHG14)組、SNHG14小干擾RNA+miR-144-3p陰性對照(si-SNHG14+anti-miR-con)組、SNHG14小干擾RNA+miR-144-3p特異性寡核苷酸抑制劑(si-SNHG14+anti-miR-144-3p)組,轉(zhuǎn)染6 h后更換為RPMI 1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細胞.

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測細胞中SNHG14、miR-144-3p的表達水平：取各組細胞,RNA提取：加入Trizol提取細胞總RNA,冰上5 min,加入200 μL氯仿,室溫放置5 min,經(jīng)12000 g離心15 min,吸取水相層置于EP試管內(nèi),加入500 μL異丙醇,室溫放置20 min,相同離心條件下離心15 min,棄上清,加入75%乙醇離心5 min,棄上清,RNA沉于管底,利用紫外分光光度計檢測RNA濃度.SNHG14正向引物5’-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3’,反向引物：5’-CTTCCAAAAGCCTTCTGCCTTAG-3’； β-actin正向引物5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’,反向引物：5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’； miR-144-3p正向引物5’-TACTGCATCAGGAACTGACTGGA-3’,反向引物：5’-TACTGCATCAGGAACTGACTGGA-3’； U6正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,反向引物：5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’,引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成.按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA.qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min,95 ℃30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共循環(huán)35次.miR-144-3p以U6為內(nèi)參,SNHG14以β-actin為內(nèi)參,反應(yīng)結(jié)束后,采用2-ΔΔCt法計算SNHG14、miR-144-3p相對表達量.

1.2.3 MTT檢測細胞增殖：收集轉(zhuǎn)染后各組胃癌MGC-803細胞,胰蛋白酶消化,制備細胞懸浮液(3×105個/mL)接種于96孔板(100 μL/孔),分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時加入MTT溶液20 μL,室溫孵育4 h,棄上清,分別加入二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶液150 μL,放入搖床內(nèi)孵育10 min,應(yīng)用酶標儀檢測各孔OD值.

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：收集各組對數(shù)生長期胃癌MGC-803細胞,預(yù)冷PBS洗滌,胰蛋白酶消化,4 ℃條件下經(jīng)10000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,PBS洗滌,加入1 mL結(jié)合緩沖液,相同條件下離心,棄上清,加入200 μL結(jié)合緩沖液,加入5 μL 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素與碘化丙錠,室溫避光孵育20 min,加入400 μL結(jié)合緩沖液,于1 h內(nèi)置于流式細胞儀檢測細胞凋亡率.

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測：starBase靶基因預(yù)測SNHG14與miR-144-3p存在結(jié)合位點,將含有結(jié)合位點及突變結(jié)合位點的SNHG14-3’UTR片段分別插入PGL3熒光素酶報告基因載體,構(gòu)建野生型(WT-SNHG14)與突變型(MUT-SNHG14)載體,將WT-SNHG14、MUTSNHG14分別與miR-144-3p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,檢測各組熒光素酶活性.

1.2.6 Western blot檢測cyclinD1、Bcl-2、p21、Bax與PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達：取各組細胞,加入RIPA蛋白裂解液提取蛋白,BCA定量蛋白,取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,取分離蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜,PVDF膜置于脫脂奶粉(50 g/L)中封閉1 h,加入蛋白一抗(1：1000),4 ℃孵育24 h,室溫孵育二抗(1：2000)2 h,滴加ECL顯影液,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光成像,采用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值.

統(tǒng)計學(xué)處理利用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,本研究數(shù)據(jù)均以mean±SD表示,各組數(shù)據(jù)均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞株中SNHG14和miR-144-3p的表達 與人胃黏膜上皮正常細胞GES-1相比,胃癌細胞MKN-45、BGC-823、MGC-803、HGC-27中SNHG14的表達水平顯著升高(P＜0.05),miR-144-3p的表達水平顯著降低(P＜0.05),其中SNHG14在胃癌MGC-803細胞中的表達水平相對較高,因而選用胃癌MGC-803細胞進行后續(xù)研究(表1).

2.2 干擾SNHG14表達對胃癌細胞MGC-803增殖和凋亡的影響 與si-con組相比,si-SNHG14組胃癌MGC-803細胞活力顯著降低(P＜0.05),細胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)(圖1、表2).

2.3 干擾SNHG14表達對胃癌細胞MGC-803增殖相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 Western blot檢測細胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達,結(jié)果顯示相較于si-con組,si-SNHG14組胃癌MGC-803細胞中cyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05),p21、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05)(圖2、表3).

2.4 SNHG14靶向調(diào)控miR-144-3p的表達的影響starBase預(yù)測顯示SNHG14與miR-144-3p存在互補核苷酸序列(圖3).雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示miR-144-3p組(WT-SNHG14)熒光素酶活性顯著低于miR-con組(WT-SNHG14)(P＜0.05),miR-144-3p組(MUT-SNHG14)與miR-con組(MUT-SNHG14)熒光素酶活性相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表4).qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,si-SNHG14組胃癌MGC-803細胞中miR-144-3p的表達水平顯著高于si-con組(P＜0.05),pcDNA-SNHG14組胃癌MGC-803細胞中miR-144-3p的表達水平顯著低于pcDNA組(P＜0.05)(表5).

2.5 干擾miR-144-3p部分逆轉(zhuǎn)沉默SNHG14對胃癌細胞MGC-803的抑制作用 與si-SNHG14+anti-miR-con組相比,si-SNHG14+anti-miR-144-3p組胃癌MGC-803細胞活力顯著增強(P＜0.05),細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05),cyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05),p21、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)(圖4、表6、表7).

2.6 沉默SNHG14表達和干擾miR-144-3p表達對胃癌細胞AKT信號通路的影響 實驗結(jié)果顯示,與si-con組相比,si-SNHG14組胃癌MGC-803細胞中p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05),si-SNHG14+anti-miR-144-3p組胃癌MGC-803細胞中p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著高于si-SNHG14+anti-miR-con組(P＜0.05)(圖5、表8).

3 討論

LncRNA與miRNA存在相互調(diào)控作用并可在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,LncRNA可靶向結(jié)合miRNA形成競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)進而降低miRNA對靶基因的抑制作用[8,9].研究表明LncRNA表達異常與胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10].但仍有部分LncRNA在胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的作用機制尚未完全闡明.

SNHG14在腎透明細胞癌中呈高表達,并可促進細胞遷移及侵襲[11].非小細胞肺癌中SNHG14通過充當(dāng)miR-340的ceRNA而發(fā)揮致癌功能[12].研究表明SNHG14還可通過調(diào)節(jié)miR-206/YWHAZ促進宮頸癌進展[13].本研究結(jié)果顯示SNHG14在胃癌細胞中呈高表達,干擾SNHG14表達后胃癌細胞增殖能力顯著降低,細胞凋亡率顯著增加,提示干擾SNHG14表達可顯著降低胃癌細胞增殖能力,促進細胞凋亡.研究報道指出cyclinD1、p21是細胞增殖相關(guān)蛋白,Bcl-2、Bax是細胞凋亡相關(guān)蛋白,cyclinD1是細胞周期由G1期轉(zhuǎn)化為S期的關(guān)鍵蛋白,其表達活性降低可促使細胞周期停滯,p21可抑制cyclinD1-CDK復(fù)合物從而誘導(dǎo)細胞周期阻滯,Bcl-2表達水平升高可抑制細胞凋亡,Bax表達水平升高可促進細胞凋亡[14,15].本研究結(jié)果顯示干擾SNHG14表達后,cyclinD1、Bcl-2明顯減少,p21、Bax、cleaved caspase-3表達顯著升高,提示干擾SNHG14表達可抑制cyclinD1、Bcl-2的表達及促進p21、Bax的表達從而抑制細胞增殖,促進細胞凋亡.

miR-144-3p在胰腺癌中呈低表達,上調(diào)miR-144-3p表達可抑制細胞侵襲及轉(zhuǎn)移[16].研究表明miR-144-3p可通過抑制TMEM16A表達從而抑制骨肉瘤細胞增殖及侵襲[17].miR-144-3p還可通過下調(diào)NFE2L2表達從而抑制宮頸癌細胞增殖及侵襲[18].本研究結(jié)果顯示miR-144-3p在胃癌細胞中的表達水平顯著降低,通過雙熒光素酶報告實驗結(jié)果證實SNHG14可靶向調(diào)控miR-144-3p的表達,進一步研究顯示干擾miR-144-3p可部分逆轉(zhuǎn)沉默SNHG14對胃癌細胞的增殖的抑制作用及細胞凋亡的促進作用.提示干擾SNHG14可通過充當(dāng)miR-144-3p的ceRNA從而抑制胃癌細胞增殖,促進細胞凋亡.研究表明PI3K/AKT信號通路可參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展進程,p-PI3K可通過激活下游AKT形成p-AKT從而激活下游Bcl-2最終抑制細胞凋亡,通過抑制PI3K/AKT信號通路激活可促進胃癌細胞凋亡[19].本研究結(jié)果顯示干擾SNHG14表達后胃癌細胞中p-PI3K、p-AKT表達水平顯著降低,提示干擾SNHG14表達可抑制PI3K/AKT信號通路激活.進一步研究顯示干擾miR-144-3p部分逆轉(zhuǎn)沉默SNHG14對胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路激活的抑制作用.提示干擾SNHG14表達可通過上調(diào)miR-144-3p表達及抑制PI3K/AKT信號通路激活而促進胃癌細胞凋亡,抑制細胞增殖.

表1 胃癌細胞中SNHG14和miR-144-3p的表達(mean±SD,n=9)

表2 下調(diào)SNHG14表達對胃癌細胞MGC-803增殖和凋亡的影響(mean±SD,n=9)

表3 干擾SNHG14表達對胃癌細胞MGC-803中Bcl-2、Bax、cyclinD1和p21蛋白表達的影響

圖1 流式細胞術(shù)檢測胃癌細胞MGC-803凋亡率.NC：空白組； si-con：陰性對照組； si-SNHG14：SNHG14小干擾RNA組.

表4 雙熒光素酶報告實驗(mean±SD,n=9)

表5 SNHG14調(diào)控miR-144-3p的表達(mean±SD,n=9)

表6 干擾miR-144-3p部分逆轉(zhuǎn)沉默SNHG14抑制胃癌細胞MGC-803增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用(mean±SD,n=9)

圖2 蛋白免疫印跡法檢測胃癌細胞MGC-803中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cyclinD1和p21蛋白的表達.NC：空白組； si-con：陰性對照組； si-SNHG14：SNHG14小干擾RNA組； cyclinD1：細胞周期蛋白1； Bcl-2：B淋巴細胞瘤2； Bax：Bcl-2相關(guān)X蛋白； cleaved caspase-3：活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3.

表7 干擾miR-144-3p部分逆轉(zhuǎn)沉默SNHG14抑制胃癌細胞MGC-803中Bcl-2、Bax、cyclinD1和p21蛋白表達的作用(mean±SD,n=9)

表8 沉默SNHG14表達和干擾miR-144-3p表達對胃癌細胞AKT信號通路蛋白和凋亡蛋白表達的影響(mean±SD,n=9)

圖3 SNHG14與miR-144-3p存在的互補核苷酸序列.

綜上所述,SNHG14能夠靶向結(jié)合并下調(diào)miR-144-3p表達從而促進胃癌細胞增殖,抑制細胞凋亡,其作用機制可能與PI3K/AKT信號通路激活有關(guān),可為胃癌的診斷、治療及預(yù)后評估提供潛在靶點.

文章亮點

實驗背景

1.3 排除標準 凝血功能障礙、心功能不全等不能接受穿刺者。所有患者先US-FNAC，得到滿意的細胞學(xué)檢查結(jié)果后手術(shù)切除，均有手術(shù)病理診斷術(shù)前簽署知情同意書。

胃癌發(fā)病機制尚未闡明,我國胃癌發(fā)病率與死亡率逐年增加,由于早期胃癌患者臨床癥狀不明顯導(dǎo)致患者就診時已處于進展期甚至晚期,臨床采用手術(shù)或放化療技術(shù)進行治療,效果一般,近年來,基因靶向治療成為多種腫瘤治療的新手段,因而尋找胃癌治療潛在靶點具有重要意義.

實驗動機

本研究首先觀察SNHG14在胃癌細胞中的表達,分析其表達變化對胃癌細胞增殖及凋亡的影響,通過starBase預(yù)測SNHG14下游可能作用的靶基因,初步分析其對靶基因的調(diào)控作用機制,為進一步闡釋SNHG14在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制提供新方向.

圖4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和蛋白免疫印跡法檢測胃癌細胞MGC-803中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cyclinD1和p21蛋白表達.sicon：陰性對照組； si-SNHG14：SNHG14小干擾RNA組； si-SNHG14+anti-miR-con：SNHG14小干擾RNA+miR-144-3p陰性對照組； si-SNHG14+anti-miR-144-3p：SNHG14小干擾RNA+miR-144-3p特異性寡核苷酸抑制劑組； cyclinD1：細胞周期蛋白1； Bcl-2：B淋巴細胞瘤2；Bax：Bcl-2相關(guān)X蛋白； cleaved caspase-3：活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3.

圖5 蛋白免疫印跡法胃癌細胞中AKT信號通路蛋白的表達.si-con：陰性對照組； si-SNHG14：SNHG14小干擾RNA組； si-SNHG14+anti-miR-con：SNHG14小干擾RNA+miR-144-3p陰性對照組； si-SNHG14+anti-miR-144-3p：SNHG14小干擾RNA+miR-144-3p特異性寡核苷酸抑制劑組； PI3K：磷脂酰肌醇激酶； p-PI3K：磷酸化PI3K； AKT：蛋白激酶B； p-AKT：磷酸化AKT.

實驗?zāi)繕?/p>

本研究目標是揭示SNHG14對胃癌細胞增殖及凋亡的影響及其分子機制,為揭示胃癌的發(fā)病機制提供新策略.

實驗方法

本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾SNHG14對胃癌細胞增殖及凋亡的影響； 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測干擾SNHG14的效果； MTT檢測干擾SNHG14對胃癌細胞增殖的影響； 流式細胞儀檢測干擾SNHG14對胃癌細胞凋亡的影響； 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CSNHG14與靶基因的調(diào)控作用； 抑制靶基因表達進行回復(fù)實驗以此驗證SNHG14對胃癌細胞增殖及凋亡的作用； 采用Western blot法檢測干擾SNHG14的表達及抑制靶基因表達對胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路的影響.

實驗結(jié)果

本研究結(jié)果表明SNHG14在胃癌細胞中高表達,干擾SNHG14的表達可通過上調(diào)靶基因的表達從而抑制胃癌細胞增殖及促進細胞凋亡,其作用機制可能是通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路而發(fā)揮作用.

實驗結(jié)論

SNHG14通過抑制靶基因表達從而促進胃癌細胞增殖、抑制細胞凋亡,SNHG14可能作為胃癌基因治療的潛在靶點.

展望前景

關(guān)于SNHG14在胃癌中的作用機制還需進行體內(nèi)實驗及臨床研究分析,同時還可進一步驗證SNHG14靶基因的下游靶mRNA,擬尋找胃癌中LncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控機制網(wǎng)絡(luò).