吳小敏 趙佳福 倪鍇 朱曉峰 許厚強(qiáng)

（1. 貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025）

熱休克蛋白（Heatshock protein，HSP）是生物體在不良因素作用下產(chǎn)生的一組特殊應(yīng)激蛋白［1］，在分子伴侶活動(dòng)、細(xì)胞分裂、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程具有調(diào)控作用［2］。此外，HSP還參與腫瘤及病毒感染調(diào)控［3］，在疾病的發(fā)生中扮演重要角色。HSP70作為HSP家族的主要成員之一，是生物體中普遍存在一種高度保守的蛋白［4-5］，由于其應(yīng)激反應(yīng)最為敏感，以及在醫(yī)學(xué)臨床中發(fā)揮的重要作用［6］使得HSP70成為HSP家族中研究最為深入的一種。大量研究表明，HSP70可通過介入信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來影響機(jī)體功能。如TGF-β信號(hào)在腫瘤發(fā)生早期具有抑制細(xì)胞增生的作用，過表達(dá)HSP70后對TGF-β信號(hào)通路有著明顯的抑制作用［7］。除此之外，HSP70家族可以作為細(xì)胞應(yīng)激的強(qiáng)效緩沖系統(tǒng)，使得腫瘤細(xì)胞很大程度上依賴這一緩沖系統(tǒng)生存［8］。HSPA8屬于HSP70家族組成型表達(dá)的同源蛋白［9］，是該家族的主要管家蛋白質(zhì)，占細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的1%［10］，正常情況下低表達(dá)或不表達(dá)，應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)HSP編碼基因被激活進(jìn)行表達(dá)［11］，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白的正確折疊、移位及降解等過程［12-13］，維持細(xì)胞的正常形態(tài)及功能，保證細(xì)胞的穩(wěn)定性。目前關(guān)于HSPA8基因及其表達(dá)產(chǎn)物在機(jī)體發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚不完全清楚，需進(jìn)一步深入研究。本研究通過克隆人HSPA8基因CDS區(qū)，運(yùn)用在線軟件對HSPA8基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建pEGFP-C1-HSPA8重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，觀察其亞細(xì)胞定位情況，旨在為進(jìn)一步研究HSPA8的胞內(nèi)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及細(xì)胞 pMD-19-T載體、pEGFPC1載體分別購自TaKaRa公司和BioVector公司；JM109感受態(tài)細(xì)胞、人前列腺癌細(xì)胞和HEK-293T細(xì)胞由貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與儀器 Trizol Reagent；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取物試劑盒（康為）；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN）；膠回收試劑盒、2×Taq PCR Master mix（康為）；限制性內(nèi)切酶BamHI、KpnI及T4 DNA ligase 連接酶（TaKaRa）；瓊脂粉、胰蛋白胨、氨芐青霉素（OXOID）；DMEM細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶、OPti-MEM?培養(yǎng)基（gibco）；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒（ThermoFisher公司）；倒置熒光顯微鏡（Nikon）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的人HSPA8（NM_006597.5）基因序列，利用premer premer 5.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增HSPA8基因特異性引物，上游引物 HSPA8-F：5'-GGGGTACCTCCTACAC CC CAGCAACCATG-3'，下游引物HSPA8-R：5'-CGGGATCCGCTACATCTACACTTGGTTG GC TTA-3'，上下游分別加入酶切位點(diǎn)KpnI和BamH，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1980 bp，送上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2HSPA8基因的克隆

1.2.2.1 總RNA的提取與目的基因的擴(kuò)增 在超凈工作臺(tái)內(nèi)，以人前列腺癌細(xì)胞為材料，按照Trizol說明書提取總RNA，根據(jù)康為逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，采用2×Taq PCR Master Mix試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增DNA目的片段，優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，RNase-Free Water 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，63℃ 退火30 s，72℃延伸 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，如檢測結(jié)果均正確，送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，檢測其準(zhǔn)確性，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 pMD-19-HSPA8亞克隆載體的構(gòu)建 將PCR膠回收產(chǎn)物按照說明書連接pMD19-T載體，連接體系 10 μL ：PCR 產(chǎn)物 4 μL，p MD19-T 1 μL，Solution I 5 μL，在16℃條件下連接過夜或更長。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，12 h后進(jìn)行菌液PCR鑒定，對鑒定為陽性的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，利用雙酶切進(jìn)一步鑒定其正確性，用于下一步實(shí)驗(yàn)。雙酶切體系為20μL ：質(zhì)粒 6 μL、Buffer 2 μL、限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI各 1 μL、ddH2O 10 μL，37℃水浴鍋酶切 3 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定均正確的質(zhì)粒，裝樣送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3HSPA8基因的生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)在線軟件ProtParam、SOPMA及SWISS-MODE對HSPA8基因理化性質(zhì)分析、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，同時(shí)利用 GenBank 中登錄的人和動(dòng)物HSPA8基因序列繪制遺傳進(jìn)化樹，并運(yùn)用在線軟件STRING、PSORT II Prediction對HSPA8相互作用蛋白和HSPA8蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測分析。

1.2.4 pEGFP-C1-HSPA8重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以構(gòu)建的T克隆載體為模板，采用KpnI、BamH I 兩種限制性內(nèi)切酶分別酶切pMD-19-HSPA8和pEGFP-C1兩質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別膠回收目的片段，將pEGFP-C1與pMD-19-HSPA8目的片段的膠回收產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA ligase 16℃過夜連接，采用含卡那霉素的LB瓊脂平板篩選陽性菌落，構(gòu)建pEGFP-C1-HSPA8重組真核表達(dá)載體。（構(gòu)建方法同2.2亞克隆載體的構(gòu)建）。

1.2.5 pEGFP-C1-HSPA8真核表達(dá)載體在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位 將培養(yǎng)至對數(shù)期的HEK-293T細(xì)胞接種于8孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以pEGFP-C1空載體為對照組，pEGFP-C1-HSPA8為試驗(yàn)組，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，置于37℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h后進(jìn)行亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。具體參照趙佳福等［14］在研究從江香豬亞細(xì)胞定位情況中實(shí)驗(yàn)步驟（固定、破膜、染核在暗室操作）。

2 結(jié)果

2.1 pMD-19-HSPA8亞克隆載體鑒定結(jié)果

挑取單菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其正確性，結(jié)果顯示，在1、2、3泳道出現(xiàn)1980 bp目的條帶，見圖1；提取對應(yīng)菌株的質(zhì)粒DNA，采用KpnI、BamH I兩種酶進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示在1、2、3泳道出現(xiàn)1980 bp和2692 bp兩條亮帶，結(jié)果見圖2，表明對應(yīng)的菌株已成功將目的基因克隆進(jìn)載體pMD-19中。

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 人HSPA8蛋白理化性質(zhì)分析 利用在線軟件（https：//web.expasy.org/protparam/） 對 HSPA8蛋 白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示人HSPA8基因的CDS區(qū)全長為1941 bp，分子式為C3111H4998N860O994S17，蛋白的分子量為70.89 kD，共編碼646個(gè)氨基酸，其中含量較高的氨 基酸有賴氨酸（8.4%）、甘氨酸（8.2%）和丙氨酸（7.7%），含量較少的是組氨酸（1.1%）、胱氨酸（0.6%）和色氨酸（0.3%）；帶正電荷的殘基總數(shù)（精氨酸+賴氨酸）82個(gè)，帶負(fù)電的殘基總數(shù)（天冬氨酸 + 谷氨酸）95個(gè)，其在哺乳動(dòng)物體外網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)大于20 h，大腸桿菌體內(nèi)大于10 h，理論等電點(diǎn)為5.37，預(yù)測HSPA8蛋白屬于親水性蛋白。

圖1 PCR擴(kuò)增凝膠電泳檢測結(jié)果

圖2 雙酶切凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2.2 HSPA8蛋白二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 在線軟件SOPMA對HSPA8蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果顯示：HSPA8蛋白二級結(jié)構(gòu)豐富，其中α-螺旋占41.64%，延伸鏈占18.42%，β-轉(zhuǎn)角占7.74%，無規(guī)則卷曲占32.20%（圖 3）。

2.2.3 HSPA8蛋白三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 在線軟件SWISS-MODEL對HSPA8蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果見圖4，該蛋白中α-螺旋和無規(guī)卷曲所占比列最高，與二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相符。

2.2.4 人HSPA8基因遺傳進(jìn)化分析 運(yùn)用生物信息學(xué)軟件MEGA6.0繪制人與其他動(dòng)物HSPA8基因的遺傳進(jìn)化樹。由圖5可知，人與黑猩猩的HSPA8基因位于同一分支，遺傳距離最近；而與虹鱒魚的HSPA8基因位于不同分支，且遺傳距離最遠(yuǎn)。

圖3 HSPA8蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖4 HSPA8蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 人與其他動(dòng)物HSPA8基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2.5 與HSPA8相互作用的蛋白 通過STRING在線軟件分析與HSPA8相互作用蛋白，結(jié)果顯示：HSPA8蛋 白 與 BAG2、BAG5、DNAJB1、DNAJB6、DNAJC3、DNAJC5、DNAJC6、GAK、HSP90A1A和HSP90AB1等10種蛋白具有蛋白間相互作用（圖 6）。

圖6 與HSPA8相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.2.6 HSPA8蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用在線軟件PSORT II Prediction對HSPA8蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示：HSPA8蛋白的細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中占65.2%，細(xì)胞核占30.4%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)占4.4%。

2.3 pEGFP-C1-HSPA8重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果如圖7，在泳道1-2出現(xiàn)1980 bp的亮帶，提取對應(yīng)泳道質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（圖8），2個(gè)酶切產(chǎn)物檢測均在1980 bp和4700 bp左右出現(xiàn)單一亮帶，表明pEGFP-C1-HSPA8真核表達(dá)載體已構(gòu)建成功。

圖7 菌液PCR凝膠電泳檢測結(jié)果

2.4 熒光共定位檢測HSPA8蛋白在細(xì)胞中的定位

通過熒光共定位檢測發(fā)現(xiàn)（圖9），HSPA8蛋白在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均有表達(dá)，均勻分布于整個(gè)細(xì)胞。

圖8雙酶切凝膠電泳檢測結(jié)果

圖9 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞熒光顯微鏡觀察

3 討論

大量研究表明，HSPA8與諸多細(xì)胞功能存在聯(lián)系。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，伴侶輔助因子通過調(diào)節(jié)HSPA8活性來調(diào)控ATP的結(jié)合與水解，如抗凋亡蛋白BAG-1依賴HSP40加速刺激HSPA8對ATP的水解，推動(dòng)ATP與ADP之間的循環(huán)［14］，HSPA8的另一主要細(xì)胞功能是參與蛋白質(zhì)折疊，不僅結(jié)合未折疊的新合成蛋白質(zhì)，還與各種蛋白質(zhì)聚集體相互作用并減少其形成［15］。此外，HSPA8在細(xì)胞蛋白質(zhì)降解過程中發(fā)揮重要作用，如在ACT（肌動(dòng)蛋白），CRYA（晶狀體蛋白）或HIS2H2AC /H2A進(jìn)行泛素化及其隨后的蛋白酶體降解，都需要HSPA8的參與［16］。隨著HSPA8的深入研究，發(fā)現(xiàn)HSPA8蛋白與多種疾病蛋白存在相互作用，如博爾納病毒蛋白X、乳頭瘤病毒蛋白L229和流感病毒蛋白M1等，這些相互作用與其核質(zhì)穿梭特性相結(jié)合，使HSPA8分子伴侶在病毒感染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。α-突觸核蛋白在退化的多巴胺神經(jīng)元中積累是帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）的主要致病蛋白，而HSPA8能有效地分離α-突觸核蛋白，并促進(jìn)解聚成無毒的α-突觸核蛋白單體［17］。甲基轉(zhuǎn)移酶METTL21A能夠甲基化HSPA8蛋白，且改變HSPA8對帕金森病相關(guān)蛋白α-突觸核蛋白的單體和纖維形式的親和力，而HSPA8的C末端尾部中的靶賴氨酸的突變消除了它們的甲基化［18］。因此HSPA8活性對預(yù)防PD病理學(xué)至關(guān)重要。近年一些研究報(bào)道，HSPA8對腫瘤與癌細(xì)胞的擴(kuò)散與抑制存在一定聯(lián)系，HSPA8能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長并改變細(xì)胞活力［19］，這對于癌癥治療的藥物靶標(biāo)具有重要意義。如山楂酸（Maslinic acid，MA）是一種天然五環(huán)三萜，對各種類型的癌細(xì)胞都具有細(xì)胞毒活性，MA能夠通過下調(diào)Panc-28細(xì)胞中的HSPA8誘導(dǎo)自噬［20］。

本研究克隆人HSPA8基因CDS區(qū)，序列比對分析發(fā)現(xiàn)人與黑猩猩的同源性最高（99%），這與HSPA8基因遺傳進(jìn)化樹結(jié)果相一致，說明人與黑猩猩親源關(guān)系最近。HSPA8蛋白分析發(fā)現(xiàn)，HSPA8蛋白存在N-末端核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Nucleotidebinding domain，NBD）和C-末端底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Substrate-binding domain，SBD），兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是變構(gòu)偶聯(lián)的，NBD負(fù)責(zé)結(jié)合和水解ATP，SBD與底物蛋白結(jié)合；HSPA8蛋白相互作用預(yù)測顯示，與之作用的蛋白共10種，主要包括J蛋白家族與BAG家族。BAG家族多個(gè)成員作為HSPA8伴侶蛋白，促進(jìn)HSP70和HSC70蛋白釋放ADP的核苷酸交換因子（Nucleotide exchange factor，NEF），從而觸發(fā)底物蛋白釋放，通過與HSPA8的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合介導(dǎo)核苷酸釋放，與底物結(jié)構(gòu)域結(jié)合介導(dǎo)底物釋放［21］。如BAG1和BAG3的BAG結(jié)構(gòu)域和HSPA8 NBD之間的相互作用介導(dǎo)核苷酸的釋放，從而加速HSPA8中ADP釋放［22］。J蛋白家族成員主要通過J結(jié)構(gòu)域與HSPA8結(jié)合。在預(yù)測的蛋白中共有4個(gè)J蛋白家族成員，值得注意的是DNAJC6在早發(fā)性PD中存在突變［23］，是否暗示DNAJC6與HSPA8相互作用對PD具有重要調(diào)控作用。除了預(yù)測的成員外，在線人類孟德爾遺傳（Online mendelian inheritance in man，OMIM）數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，HSPA8還與其他大量的J蛋白家族成員存在相互作用，如DNAJB2、DNAJC21和DNAJC7等；蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，人HSPA8蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)（65.2%），通過HSPA8蛋白與EGFP融合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該蛋白均勻分布于整個(gè)細(xì)胞，這與預(yù)測結(jié)果存在差異，但該結(jié)果與Rashedan等［24］研究一致。進(jìn)一步通過癌癥基因組（The cancer genome atlas，TCGA）計(jì)劃數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，人HSPA8蛋白主要分布在細(xì)胞膜與細(xì)胞核，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。同時(shí)在TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)HSPA8與 DNAJC21、HDJC9、DNAJB12和 DNAJB14存 在相互作用，其中DNAJC21和HDJC9主要定位在細(xì)胞核，通過與HSPA8相互作用來維持細(xì)胞的正常形態(tài)與功能［25-26］；DNAJB12和DNAJB14是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的跨膜蛋白，其作為HSPA8蛋白的伴侶蛋白，可將HSPA8招募到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，對膜蛋白中錯(cuò)誤折疊的蛋白進(jìn)行降解［27］。這些研究表明HSPA8通過定位至細(xì)胞核與細(xì)胞膜來行使功能，進(jìn)一步驗(yàn)證HSPA8蛋白定位于細(xì)胞膜與細(xì)胞核。此外，研究發(fā)現(xiàn)，HSPA8蛋白在熱誘導(dǎo)的應(yīng)激過程中被抑制，HSPA8蛋白被限制在細(xì)胞核內(nèi)［28］，表明HSPA8可在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)間穿梭，該過程受何種蛋白調(diào)控，以及限制在核內(nèi)行使的功能還需進(jìn)一步研究。本研究成功克隆人HSPA8基因CDS區(qū)，生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位結(jié)果為今后深入研究該基因的生物學(xué)功能及全面了解HSPA8在細(xì)胞內(nèi)的作用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功克隆了人HSPA8基因CDS區(qū)，并對序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。構(gòu)建了pEGFP-HSPA8真核表達(dá)載體，亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)HSPA8-GFP融合蛋白均勻地分布在293-T細(xì)胞中。