郭小莉，李紅娟，高如意，楊曉筱，柏偉榮，肖 偉

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 連云港222001）

人參須為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Meyer的細枝根及須根，傳統(tǒng)認(rèn)為人參主根效力強，而參須效果差，故前者價格較后者貴得多［1］。目前，關(guān)于人參須提取物制備工藝功效成分的檢測以人參皂苷［2］、人參多糖［3］為主。

人參須浸膏是為人參須經(jīng)水提取、濃縮、精制而成，含多糖、皂苷、黃酮等多種成分［4］，黏性大，不容易干燥，采用噴霧干燥時易粘壁，有效成分受熱容易損失［5-6］；板式真空干燥時時間比較長，有效成分受熱不穩(wěn)定，會有損失；冷凍干燥時干燥品性狀較好，但成本較高；真空帶式干燥是一種具有連續(xù)進料和出料形式的接觸式真空干燥設(shè)備，在整個干燥過程中處于真空、封閉環(huán)境下［7］，具有干燥時間短、有效成分轉(zhuǎn)移率高、可連續(xù)化生產(chǎn)等特點［8］，既保證了產(chǎn)品質(zhì)量，又提高了經(jīng)濟效益，但目前尚無將其應(yīng)用于人參須酚類成分的報道。因此，本實驗通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化人參須浸膏真空帶式干燥工藝，并檢測其總酚對酪氨酸酶的抑制活性［9］。

1 材料

UV-2700紫外分光光度儀（日本島津公司）；Sartorius BSA224S-CW 電子分析天平（德國賽多利斯公司）；FA2004分析天平（上海舜宇衡平科學(xué)儀器有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；LYO-1 m2冷凍干燥機（上海東富龍科技股份有限公司）；板式真空干燥箱（杭州三特醫(yī)藥化工設(shè)備有限公司）；MTVBD-1-4-1真空帶式干燥機（上海郎脈新化工技術(shù)有限公司）；B-290噴霧干燥機（瑞士Buchi 公司）；Flex 3多功能酶標(biāo)儀（江蘇省科學(xué)器材有限公司）；R2002B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）。

人參須浸膏（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號20170911，總酚含有量1.67%）。沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110831-201605，含有量90.8%）；蘑菇酪氨酸酶（貨號T3824-25Ku，2 687 U／mg）、酪氨酸（色譜純，含有量98%）（美國Sigma 公司）。所用試劑均為分析純；水為超純水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 浸膏制備 藥材去除雜質(zhì)，洗凈，加入10倍量水回流提取2次，每次2 h，藥液過濾，濾液減壓濃縮至相對密度1.10～1.15，加乙醇至含醇量為75%，靜置過夜，收集上清液，減壓濃縮至相對密度1.20，即得。

2.2 總酚含有量測定［9］

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品50 mg，置于100 mL 棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密吸取5 mL，置于50 mL 棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL 含沒食子酸50 μg）。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取干膏粉25 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于具塞試管中，加水補至1.0 mL，加入4 mL 2% 碳酸鈉，搖勻，室溫下放置2 min，加入0.2 mL 50%福林酚試劑，搖勻，室溫下放置30 min，以相應(yīng)試劑為空白，紫外-可見分光光度法在750 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4 轉(zhuǎn)移率測定 精密量取供試品溶液1 mL，按“2.2.3”項下方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定總酚含有量，計算轉(zhuǎn)移率，公式為轉(zhuǎn)移率=［干膏中總酚含有量×干膏質(zhì)量／（浸膏中總酚含有量×浸膏質(zhì)量）］×100%。

2.3 干膏含水量測定 精密稱取干膏2 g，按照2015年版《中國藥典》 四部通則0832水分測定法第二法（烘干法）測定。

2.4 干燥方式比較［8］

2.4.1 板式減壓干燥 稱取浸膏3 kg，置于板式減壓干燥箱中，溫度65 ℃，真空度-0.08～-0.1 MPa，記錄干燥時間、干膏含水量、總酚轉(zhuǎn)移率。

2.4.2 真空冷凍干燥 稱取浸膏3 kg，加水稀釋至相對密度1.1，將其平鋪于鐵盤中，高度不超過10 mm，預(yù)凍溫度-45 ℃，設(shè)定時間1 min，保持4 h；升華干燥溫度20 ℃，設(shè)定時間30 min，保持4 h；解析干燥溫度25 ℃，設(shè)定時間15 min，保持4 h，記錄干燥時間、干膏含水量、總酚轉(zhuǎn)移率。

2.4.3 噴霧干燥 稱取浸膏3 kg，加水稀釋至相對密度1.1，設(shè)定噴霧干燥機進風(fēng)溫度175 ℃（波動范圍±5 ℃），出風(fēng)溫度90～95 ℃，收集噴干粉，記錄干燥時間、干膏含水量、總酚轉(zhuǎn)移率。

2.4.4 真空帶式干燥 稱取浸膏3 kg，加熱區(qū)溫度90 ℃，進料速度1.5 kg／h，干燥時間2 h，收集干膏，按“2.2.4”和“2.3”項下方法分別測定總酚轉(zhuǎn)移率和干膏含水量。

2.4.5 結(jié)果分析 表1顯示，板式真空干燥時間最長，干膏含水量最高；冷凍干燥所得干膏性狀理想，總酚損失最小，含水量低，但耗時相對較長；噴霧干燥時間短，但總酚轉(zhuǎn)移率低；真空帶式干燥總酚轉(zhuǎn)移率較高，僅次于冷凍干燥，而且干燥時間短，含水量低，干膏性狀理想，故選擇該方法進行干燥。

表1 不同干燥方式比較

2.5 工藝優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果結(jié)合實際生產(chǎn)經(jīng)驗，設(shè)計單因素試驗對加熱區(qū)溫度、干燥時間、進料速度進行考察［10-12］，以總酚轉(zhuǎn)移率、干膏含水量的綜合評分為評價指標(biāo)，含水量得分=（1-含水量）×100，總酚轉(zhuǎn)移率得分=總酚轉(zhuǎn)移率／最大值×100，綜合評分=總酚轉(zhuǎn)移率得分×0.6＋干膏含水量得分×0.4。

2.5.1.1 加熱區(qū)溫度 取“2.1”項下浸膏，設(shè)定干燥時間100 min，進料速度1.5 kg／h，考察加熱區(qū)溫度60、70、80、90、100、110 ℃，結(jié)果見圖1。由圖可知，隨著加熱區(qū)溫度增加，總酚轉(zhuǎn)移率隨之升高，干膏含水量隨之降低；大于90 ℃時，對干膏含水量的影響程度降低，而且此時總酚受熱不穩(wěn)定，含有量會降低，故確定加熱區(qū)溫度為80～100 ℃。

圖1 加熱區(qū)溫度對總酚轉(zhuǎn)移率、干膏含水量的影響

2.5.1.2 干燥時間 取“2.1”項下浸膏，設(shè)定加熱區(qū)溫度90 ℃，進料速度1.5 kg／h，考察干燥時間70、80、90、100、110、120 min，結(jié)果見圖2。由圖可知，隨著干燥時間延長，總酚轉(zhuǎn)移率隨之升高，干膏含水量隨之降低；大于100 min 時，須總酚轉(zhuǎn)移率開始下降，但干膏含水量變化趨勢不大，故確定干燥時間為90～110 min。

圖2 干燥時間對總酚轉(zhuǎn)移率、干膏含水量的影響

2.5.1.3 進料速度 取“2.1”項下浸膏，設(shè)定加熱區(qū)溫度90 ℃，干燥時間100 min，考察進料速度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 kg／h，結(jié)果見圖3。由圖可知，隨著進料速度加快，總酚轉(zhuǎn)移率隨之升高，同時由于浸膏在履帶上涂布量少，故干膏含水量較低；當(dāng)大于1.5 kg／h 時，涂布在履帶上的浸膏厚度越大，水分蒸發(fā)越慢，干膏含水量越高，故確定進料速度為1.0～2.0 kg／h。

圖3 進料速度對總酚轉(zhuǎn)移率、干膏含水量的影響

2.5.2 Box-Behnken 響應(yīng)面法［13］在單因素試驗基礎(chǔ)上，以加熱區(qū)溫度（A）、干燥時間（B）、進料速度（C）為影響因素，每個因素3個水平，因素水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 因素水平

表3 試驗設(shè)計與結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進行二次多元擬合，得到綜合評分（Y）回歸方程為Y=98.18-0.016A-0.41B-0.18C＋0.37AB-0.021AC-0.74BC-2.02A2-1.32B2-1.17C2（R2=0.985 2），方差分析見表4。由表可知，模型F=51.82，P＜0.000 1，表明模型顯著；失擬項不顯著（P＞0.05），表明試驗誤差較小，模型擬合度良好；因素B、BC、AB、A2、B2、C2有顯著影響（P＜0.05）。

表4 方差分析

響應(yīng)面分析見圖4，可知最優(yōu)工藝為加熱區(qū)溫度89.43 ℃，干燥時間98.51 min，進料速度1.48 kg／h，考慮到實際生產(chǎn)操作，將其修正為加熱區(qū)溫度89 ℃，干燥時間99 min，進料速度1.5 kg／h，綜合評分98.22。然后，根據(jù)優(yōu)化工藝取浸膏3份，每份6 kg，進行3批驗證試驗，結(jié)果見表5，可知工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗證試驗結(jié)果（n=3）

2.6 總酚對酪氨酸酶的抑制活性 蘑菇酪氨酸酶具有單酚酶、二酚酶活性［14］，兩者分別以L-酪氨酸、L-多巴為底物，本實驗主要研究前者［15］。

精密稱取驗證試驗項下干膏粉75 mg（總酚含有量為9.8%），置于1 mL 量瓶中，0.05 mol／L 磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）溶解并定容，2倍稀釋法稀釋成不同質(zhì)量濃度，作為樣品溶液。取100 μL 置于96孔培養(yǎng)板中，加入80 μLL-酪氨酸溶液（2 mmol／L），與20 μL 酪氨酸酶溶液（600 μmol／L）充分混勻（組成見表6），37 ℃下孵育25 min，在490 nm 波長處檢測光密度（OD）值。以抑制率為縱坐標(biāo)，總酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，計算IC50，測定酪氨酸酶抑制率，公式為抑制率=［1-（B-B1）／（A-A1）］×100%（A、A1、B、B1分別為對照組、空白對照組、實驗組、空白實驗組在490 nm 波長處的OD 值），結(jié)果見圖5。由圖可知，總酚對酪氨酸酶有抑制作用，并呈一定濃度依賴性，IC50為2.94 mg／mL。

圖4 各因素響應(yīng)面圖

表6 反應(yīng)液組成

3 討論

與傳統(tǒng)干燥方式比較，真空帶式干燥是在真空條件下使物料經(jīng)過布料機，將浸膏較薄的部分涂布在傳送帶上，從而能連續(xù)進料和出料，所得干膏性狀及溶解性較好，而且不容易吸潮，尤其是對于含糖量高、易吸潮的中藥浸膏，能在較短時間內(nèi)得到干燥品，并且在最大程度上保留物料有效成分。本實驗通過Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化人參須浸膏真空帶式干燥工藝，并進行中試規(guī)模的驗證試驗，發(fā)現(xiàn)人參須總酚轉(zhuǎn)移率達94.22%，即能大規(guī)模保留中藥浸膏中有效成分，該方法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)具有實用價值。

圖5 酶抑制活性曲線

然后，考察人參須總酚對酪氨酸酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)它具有抑制作用，并呈一定濃度依賴性，IC50為2.94 mg／mL。目前，關(guān)于人參功效成分對酪氨酸酶的抑制作用研究大多集中在人參皂苷方面，而鮮有人參酚類成分，故本實驗結(jié)果可為人參須的加工和開發(fā)提供參考依據(jù)。