陳 貴，夏稷子，徐作剛，史 娟，鄧言歡，張 華，王 濤，安 軍

（黔南州檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 都勻558000）

地桃花為錦葵科梵天花屬植物地桃花Urena lobataL.的干燥全草，具有祛風(fēng)利濕、活血消腫、清熱解毒的功效，主治感冒、風(fēng)濕痹痛、跌打腫痛、毒蛇咬傷等［1-3］，主要含有黃酮、有機(jī)酸、多酚，功效抗氧化、抗菌、抗炎等［4-10］，其中黃酮類化合物銀鍛苷有著顯著的抗氧化、抗炎作用［11-12］。1990年版《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》 和2009年版《湖南中藥材標(biāo)準(zhǔn)》 收載了地桃花，其入藥部位為地上部分，但其質(zhì)量控制指標(biāo)僅有性狀和水分，尚無(wú)顯微鑒別、薄層鑒別、浸出物、成分含有量測(cè)定等項(xiàng)目［13-14］；蘇聰?shù)龋?5］采用HPLC 法測(cè)得廣西、廣東產(chǎn)地桃花地上部分銀鍛苷含有量范圍為0.010%～0.064%。本實(shí)驗(yàn)對(duì)12批地桃花進(jìn)行性狀鑒定及顯微、TLC 鑒別，測(cè)定水分、總灰分、浸出物含有量，并建立HPLC 法測(cè)定銀鍛苷含有量，為該藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

DM2500型顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；LC-2010A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；雙光束TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；AG135型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；BSA224S 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；SK250LHC 型超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；101-1AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱、SX-4-10型箱式電阻爐（天津市泰斯特儀器有限公司）。銀鍛苷對(duì)照品（批號(hào)170305，含有量99.34%），購(gòu)于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。G 型硅膠板（青島海洋化工有限公司，批號(hào)20 180621；青島基億達(dá)硅膠試劑廠，批號(hào)20150910）；H 型硅膠板（青島海洋化工有限公司，批號(hào)20160226）。乙腈為色譜純；其余試劑為分析純；水為娃哈哈純凈水。地桃花于2015至2016年采自貴州都勻、興仁、思南等地，經(jīng)貴州省食品藥品檢驗(yàn)所中藥標(biāo)本館李楊館長(zhǎng)鑒定為錦葵科植物地桃花Urena lobataL.的干燥全草，具體見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 形態(tài)鑒定［1］藥材根呈圓柱形，略彎曲，支根少數(shù)，上生多數(shù)須根，表面淡黃色，具縱皺紋，質(zhì)硬，斷面呈破裂狀；莖下部棕黑色至棕黃色，上部灰綠色至暗綠色，具粗淺的網(wǎng)紋，質(zhì)硬，木部斷面不平坦，皮部纖維性；葉多已破碎，完整者多皺縮，上表面深綠色，下表面粉綠色，密被短柔毛和星狀毛，掌狀網(wǎng)脈，中脈基部有一腺體，葉腋常有宿存的托葉；具花者花梗長(zhǎng)約3 mm，被綿毛；小苞片5，長(zhǎng)約6 mm，基部1／3合生；花萼杯狀，裂片5，較小苞片略短；花瓣多皺縮，常脫落；具果者果扁球形，每一分果呈球狀五等分楔形，具星狀短柔毛和錨狀刺，種子腎形；氣微，味淡。見圖1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

圖1 地桃花形態(tài)鑒定Fig.1 Morphological identification of U.lobata

2.2 顯微鑒定 藥材粉末呈黃綠色或棕黃色；色素塊棕黃色或棕紅色，形狀不規(guī)則；單細(xì)胞非腺毛眾多，單生或2～8個(gè)星狀簇生，平直或稍彎曲；腺毛頭部3～9細(xì)胞，柄部1～2細(xì)胞；纖維成束或散在，壁厚；氣孔平軸式；草酸鈣簇晶多見，直徑10～50 μm；導(dǎo)管多為孔紋導(dǎo)管和螺紋導(dǎo)管。見圖2。

圖2 地桃花顯微鑒定Fig.2 Microscopic identification of U.lobata

2.3 TLC 定性鑒別［16-17］取藥材粉末1 g，加80%甲醇25 mL，水浴回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液；取適量銀鍛苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含該成分約0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》 四部通則0502薄層色譜法試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液1 μL、供試品溶液2 μL，點(diǎn)于同一G 型硅膠薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（30 ∶1 ∶3 ∶0.5）的上層溶液為展開劑，置于展開缸中展開，取出后晾干，噴以三氯化鋁試液，并用熱風(fēng)吹干，于365 nm 紫外光燈下檢視，結(jié)果見圖3。由圖可知，在供試品、對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同的黃綠色熒光斑點(diǎn)。

圖3 地桃花TLC 色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of U.lobata

2.4 檢查項(xiàng)及浸出物［18］采用2015年版《中國(guó)藥典》 四部通則0832水分測(cè)定法第二法（烘干法）測(cè)定含水量，通則2302總灰分測(cè)定法測(cè)定總灰分含有量，通則2201項(xiàng)下醇溶性浸出物測(cè)定法（熱浸法）測(cè)定浸出物含有量（溶劑為乙醇），平行3份，結(jié)果見表2。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，初步擬定含水量不得超過(guò)15.0%，總灰分含有量不得超過(guò)11.0%，浸出物含有量不得少于5.0%。

2.5 含有量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 島津InertSustain? C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1% 冰醋酸（22 ∶ 78）；柱 溫 30 ℃；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)315 nm；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖4。在此條件下，銀鍛苷理論塔板數(shù)大于6 000，與相鄰成分色譜峰的分離度大于1.5。

表2 水分、總灰分、浸出物含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of content determination of water，total ash and extract（n=3）

圖4 銀鍛苷HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of tiliroside

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 取對(duì)照品11.99 mg，置于50 mL 量瓶中，加入80%甲醇，即得（每1 mL含238.2 μg 銀鍛苷）。

2.5.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）約1 g，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流提取1 h，放冷，80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1 mL，置 于2、10、50、250、500 mL 量瓶中，80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得到方程為Y=31 242X＋475（r=1.000 0），在0.476 4～238.2 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 取“2.5.4”項(xiàng)下同一質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次，測(cè)得銀鍛苷峰面積RSD 為0.14%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藥材粉末（批號(hào)161014），按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得銀鍛苷含有量RSD 為0.56%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材粉末（批號(hào)161014）6份，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得銀鍛苷含有量RSD 為0.28%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 取4.87 mg 對(duì)照品于200 mL 量瓶中，80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 含24.2 μg 該成分的貯備液。精密稱取含有量已知的藥材（批號(hào)161014）6份，每份0.5 g，精密加入貯備液15 mL、80% 甲醇10 mL，稱定質(zhì)量后水浴回流提取1 h，放冷，80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 銀鍛苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for tiliroside（n=6）

2.5.9 樣品含有量測(cè)定 取不同產(chǎn)地藥材粉末各約1 g，按“2.5.3”項(xiàng)下方法平行制備3份供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表4。由表可知，除了1批樣品中銀鍛苷含有量較低，僅為0.130 mg／g 外，其余各批均高于0.300 mg／g，故初步擬定其限度不得低于 0.300 mg／g，即按干燥品計(jì)算不得低于0.030%。

表4 銀鍛苷含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.4 Results of content determination of tiliroside（n=3）

3 討論

3.1 TLC 法耐用性考察 本實(shí)驗(yàn)考察了溫度（4、25、40 ℃）、相對(duì)濕度（30%、52%、80%）、廠家、類型（G 型、H 型）薄層硅膠板對(duì)銀鍛苷TLC鑒別的影響，發(fā)現(xiàn)各廠家G 型硅膠板在不同溫度、相對(duì)濕度下，TLC 色譜圖中銀鍛苷斑點(diǎn)清晰，與相鄰斑點(diǎn)分離度較好，而H 型硅膠板效果較差，故選擇G 型板。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 銀鍛苷檢測(cè)波長(zhǎng)包括266 nm［19］、315 nm［20-21］、316 nm［22］等，其中在265、315 nm處有最大吸收。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合HPLC 色譜圖中銀鍛苷吸收強(qiáng)度、相鄰峰干擾等因素，最終選擇315 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［15］報(bào)道，將水相用0.1%冰醋酸替代，可使銀鍛苷色譜峰對(duì)稱性更好。同時(shí)，用等度洗脫代替梯度洗脫時(shí)，操作更簡(jiǎn)便，所得色譜峰基線更平穩(wěn)。

3.4 提取條件選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了提取方式（回流、超聲）、提取時(shí)間（30、60、90 min）、提取溶劑（90%、80%、70%、60% 甲醇，甲醇和稀乙醇）對(duì)銀鍛苷提取的影響，發(fā)現(xiàn)80% 甲醇回流提取60 min 時(shí)效率較高。

3.5 粉末用篩選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了篩網(wǎng)（2號(hào)、3號(hào)）對(duì)銀鍛苷含有量測(cè)定的影響，發(fā)現(xiàn)2號(hào)篩處理后藥材含有大量纖維，粉末均勻性較差，平行樣偏差易超出范圍；3號(hào)篩處理后既能保證取樣均勻，又有較高的得粉率，故選擇3號(hào)篩。

3.6 HPLC 法耐用性考察 本實(shí)驗(yàn)考察了島津InertSustain? C18、Waters Symmetry? C18、Agilent ZORBAX SB-C18、AlltimaTMC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱 溫（20、25、30、35、40 ℃），色譜儀（LC-2010A、Agilent 1260），發(fā)現(xiàn)柱溫對(duì)銀鍛苷檢測(cè)影響較大，在20、25、30 ℃時(shí)峰形對(duì)稱性理想，可與相鄰峰達(dá)到基線分離，含有量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異；在35、40 ℃時(shí)出峰時(shí)間變短，與相鄰峰未達(dá)到基線分離。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)地桃花性狀、顯微、TLC 定性鑒別、HPLC 含有量測(cè)定進(jìn)行較為全面的研究，可為有效控制該藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為相關(guān)地方標(biāo)準(zhǔn)的制定及現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。