郭簡寧， 王 燕， 趙京霞， 底婷婷， 張 璐， 李寧飛， 蒙玉嬌， 郭昕煒， 劉正榮， 翟春艷， 劉 宇， 郭肖瑤， 齊 聰， 李 萍△

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)， 北京 100029； 2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院， 北京市中醫(yī)研究所， 銀屑病中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究北京市重點實驗室， 北京 100010)

銀屑病是一種以角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和分化為特征，并具有遺傳特性的炎癥性皮膚疾病，在自然人群中的患病率為0.1%～3%[1]，近年來銀屑病的發(fā)病率逐年升高。銀屑病不僅是一種自身免疫性疾病，也是一種心身疾病，其臨床典型表現(xiàn)為鱗屑性紅斑或斑塊，且皮損呈對稱分布，精神變化、情緒緊張可加重病情。臨床研究表明，銀屑病患者具有抑郁、焦慮癥的風(fēng)險，且伴發(fā)的焦慮癥往往與抑郁癥并存[2]，這些潛在的精神疾病，可能使銀屑病遷延不愈或惡化[3]。針對銀屑病患者出現(xiàn)的精神心理問題，給予改善精神心理的藥物、生物制劑和特殊心理療法有一定的治療作用[4-5]。

精神心理因素屬于中醫(yī)情志范疇，肝主情志，所以針對銀屑病的心身疾病屬性，各醫(yī)家提出“從肝論治”銀屑病，并取得了良好療效[6-8]。逍遙散有疏肝解郁，養(yǎng)血健脾之功，在臨床上可運用于治療銀屑病[9]，但其作用機制尚不明確。本實驗采用咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型進(jìn)行實驗研究[10]，此種模型小鼠伴有一定情志狀態(tài)改變[11]。故此，本項工作觀察咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠是否伴隨抑郁癥狀，從銀屑病樣皮損、行為學(xué)改變和抑郁癥相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化角度，探究逍遙散的治療效果，明確其可能的作用機制及靶點，為“從肝論治”銀屑病提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

36只SPF級雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～20 g，6～8周齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證編號為SCXK(京)2014-0013。動物實驗獲得北京中醫(yī)醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

2 試劑、藥物及儀器

2.1試劑和藥物 逍遙散采購自北京同仁堂藥店，藥物組成為：柴胡、茯苓、白術(shù)、當(dāng)歸、白芍、甘草、生姜和薄荷。組方按照成人(60 kg)的劑量，根據(jù)人與動物間藥物劑量換算比例換算成小鼠劑量[11]，按中藥常規(guī)煎煮法制作成水煎劑，每日灌胃。另有甲氨蝶呤片(上海信誼藥廠有限公司)、5%咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司)、DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) H2O2去氧離子水及抗Ki67單克隆抗體和CD3單克隆抗體(eBioscience)；山羊血清工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；甲醇(色譜純)和甲酸(色譜純)均購于北京迪科馬科技有限公司。

2.2儀器 徠卡全自動染色機、輪轉(zhuǎn)切片機，Agilent 6410 QQQ LC-MS分析系統(tǒng)由Agilent 1290液相色譜儀及Agilent 6410 QQQ三重四極桿質(zhì)譜檢測器組成，Masshunter工作站。Hettich mzkro 220R臺式低溫高速離心機，Gene G560E渦旋式混勻儀[STUART SBH130D/3樣品濃縮儀(氮吹儀)]。

3 方法

3.1動物造模、分組和給藥 參考Fits等[10]的小鼠銀屑病樣模型制備方法造模。實驗前戊巴比妥鈉(80 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，背部備皮，面積約2 cm×3 cm，備皮后單籠飼養(yǎng)。依據(jù)隨機數(shù)字表法，將小鼠隨機分為空白對照(control)組、模型(model)組、甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)組、逍遙散高、中、低劑量(Xiaoyaosang high, medium and low dose, XH、XM、XL)組，每組6只?？瞻讓φ战M小鼠背部每日涂抹凡士林，余各組小鼠背部每日涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg；灌胃抹藥前進(jìn)行，每天 1 次，每次 0.2 mL，連續(xù)8 d：空白對照組與模型組給予0.2 mL 0.9% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯化鈉注射液，甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤片溶液0.2 mL (1 mg/kg)，逍遙散高、中、低劑量組分別給予等量的不同濃度的中藥藥液，依次為7.58、3.79和1.89 kg/L。

3.2檢測指標(biāo)及方法

3.2.1一般狀態(tài)的觀察 每日觀察各組小鼠的毛發(fā)色澤、精神狀態(tài)、活動情況，以及舔舐梳理毛發(fā)次數(shù)。

3.2.2小鼠體重 造模前對各組小鼠體質(zhì)量進(jìn)行測量，造模第9天，取材前對其體質(zhì)量進(jìn)行測量，觀察小鼠造模前后體重的變化。

3.2.3小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度評分(PASI評分) 每天對實驗小鼠皮損進(jìn)行拍照，根據(jù)PASI評分標(biāo)準(zhǔn)，采用雙盲法評判各組小鼠皮損嚴(yán)重程度，即一實驗人員將小鼠組別編號打亂，采用隨機數(shù)字表法重新對小鼠編排新的序列號，找另一PASI評分經(jīng)驗豐富的實驗人員對重新編號的小鼠評分，負(fù)責(zé)本實驗的研究人員與PASI評分的實驗人員對具體各組小鼠的PASI評分并不知曉。實驗結(jié)束后對組別編號進(jìn)行揭盲，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，繪制PASI評分趨勢圖，動態(tài)觀察小鼠皮損的變化情況。

3.2.4測量小鼠皮損表皮厚度 造模第9天，取小鼠背部皮膚固定于多聚甲醛中，脫水、包埋后制備5 μm石蠟切片。用蘇木精-伊紅(hematoxylineosin，HE)染色后在400倍光鏡下拍片，每個標(biāo)本選5張不同切片，在每張切片中隨機測量5處表皮厚度，比較表皮層變化情況。

3.2.5小鼠皮損表皮層異常增生標(biāo)志物Ki67的表達(dá)及CD3+T細(xì)胞浸潤情況檢測 制備5 μm石蠟切片，分別進(jìn)行Ki67和CD3染色，使用免疫熒光法(immunofluorescence，IF)檢測Ki67的表達(dá)，Ki67是一種增生細(xì)胞相關(guān)的核抗原，陽性細(xì)胞核呈綠色熒光，免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry，IHC)檢測CD3的表達(dá)。在400倍鏡下，每例標(biāo)本隨機選取5個視野并拍照，應(yīng)用IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)記錄數(shù)據(jù)。

3.2.6糖水偏好實驗 于造模第7天，進(jìn)行糖水偏好實驗。在實驗前對各組小鼠禁食12 h，12 h后給予小鼠1瓶1 %的蔗糖水和1瓶純凈水，并稱量兩個水瓶的重量，將水瓶位置隨機放置以防小鼠位置偏愛效應(yīng)，讓其自主選擇飲水，1 h后分別稱量兩個水瓶的重量，計算出蔗糖水和純凈水的消耗量，根據(jù)公式：糖水偏愛率(%)=蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+純凈水的消耗量)×100%，計算出各組小鼠糖水偏愛率。

3.3小鼠海馬、下丘腦組織樣品處理 各組織樣品稱重，加入200 μL 0.1%甲酸-水勻漿，4 024 ×g、 4 ℃離心10 min，取上清液100 μL并加入0.1%甲酸-甲醇300 μL，混勻，15 493 ×g、 4 ℃離心10 min，取上清液350 μL氮氣吹干，以50 μL 0.1%甲酸-水復(fù)溶，15 493 ×g、 4 ℃離心10 min，取上清液進(jìn)樣。

3.4液相條件 色譜柱：Waters AtlantisTMT 3(2.1 mm×100 mm, 3 μm)。流動相為水(0.1%甲酸)和甲醇。梯度洗脫：0 min，2%甲醇；0～3 min，2%～60%甲醇，3～5 min，60%～100%甲醇。流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫30 ℃。

3.5質(zhì)譜條件 ESI離子源，正離子檢測方式，MRM模式。離子源條件為干燥氣溫度(Gas Temp)：300 ℃，干燥氣流量(Gas Flow)：10 L/min，霧化器壓力(Nebulizer)：45 psi，毛細(xì)管電壓(Capillary)：4 000 V。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計分析及作圖。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計量且正態(tài)分布資料相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)進(jìn)行統(tǒng)計分析，非正態(tài)資料采用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般狀態(tài)的觀察

造模前，各組小鼠的毛發(fā)整齊、色澤明亮，精神狀態(tài)良好、好動；造模后觀察發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型組小鼠毛發(fā)凌亂、色澤枯黃，精神萎靡，舔舐梳理毛發(fā)次數(shù)較空白組減少；甲氨蝶呤組和逍遙散各劑量組小鼠較模型組小鼠上述情況有所緩解。

2 各組小鼠體質(zhì)量變化

分別在造模前和取材前對各組小鼠體質(zhì)量進(jìn)行測量,見表1，計算各組小鼠造模前后體質(zhì)量的變化，空白對照組小鼠體質(zhì)量變化不明顯，體質(zhì)量變化幅度顯著低于模型組(P<0.01)。此外，逍遙散高劑量組體質(zhì)量變化幅度亦顯著低于模型組(P<0.05)，見圖1。

3 逍遙散對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損的影響

觀察各組小鼠皮損變化，空白對照組小鼠皮膚白嫩光滑，無鱗屑、紅斑和浸潤現(xiàn)象；模型組于第2～3天開始出現(xiàn)輕微皮損，其背部皮膚鱗屑、紅斑和浸潤，隨造模時間的延長不斷加重，第8天皮損最嚴(yán)重，銀白色鱗屑肥厚，表皮紅腫，皮膚變硬變厚浸潤明顯，銀屑病樣皮損模型形成；與模型組同期相比，甲氨蝶呤組和逍遙散各劑量組皮膚鱗屑、紅斑和浸潤情況減輕，甲氨蝶呤組與逍遙散高劑量組小鼠皮膚鱗屑、紅斑和浸潤情況改善程度明顯，見圖2。

表1 各組小鼠造模前后體質(zhì)量

Table 1.Body mass of mice in each group before and after mo-deling (g. Mean±SD.n=6)

Group Before animal modelingAfter animal modelingControl21.5±0.319.9±0.3Model22.1±0.318.4±0.6MTX22.0±0.319.2±0.5XH21.8±0.219.5±0.4XM21.8±0.319.1±0.4XL21.6±0.118.7±0.5

Figure 1.The body mass change of mice in each group before and after modeling. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖1 各組小鼠造模前后體質(zhì)量變化

Figure 2.Gross observation of mice at day 9 after modeling. A: control; B: model; C: MTX; D: XH; E: XM; F: XL.

圖2 各組小鼠于造模第9日時的皮損表現(xiàn)

制作PASI評分趨勢圖，空白對照組小鼠背部皮膚正常無改變，其鱗屑、紅斑、浸潤和總分分值始終為0；其余各組小鼠從造模第2天背部皮膚出現(xiàn)皮損起，其鱗屑、浸潤、紅斑和總分分值，隨時間推移，不同程度的升高，于第8天達(dá)到峰值，模型組的鱗屑、浸潤、紅斑和總分分值最高；其中逍遙散高劑量組可顯著降低浸潤情況和總分分值(P<0.05),甲氨蝶呤組與逍遙散中、低劑量組評分較模型組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

Figure 3.PASI scoring trend chart of skin lesions in mice of each group. PASI: psoriasis area and severity index. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖3 各組小鼠皮損PASI評分趨勢圖

4 HE染色觀察各組小鼠皮損組織形態(tài)學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，空白對照組小鼠皮膚表皮層較薄，模型組較空白對照組表皮層明顯增厚數(shù)倍，并可見明顯的角化不全及角化過度、嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤以及Munro微膿腫；甲氨蝶呤組和逍遙散各劑量組組織形態(tài)學(xué)變化相似，表皮層均比模型組薄，角化不全和角化過度減少，炎癥細(xì)胞浸潤程度減輕及Munro微膿腫減少，見圖4。

Figure 4.Histomorphological changes of mice in each group after HE staining. A: control; B: model; C: MTX; D: XH; E: XM; F: XL.

圖4 各組小鼠皮膚HE染色后組織形態(tài)學(xué)改變

測量各組小鼠表皮垂直厚度，模型組表皮層厚度比空白對照組增厚4～5倍(P<0.01)；甲氨蝶呤組和逍遙散各劑量組表皮層厚度均較模型組減少(P<0.01)，見圖5。

5 各組小鼠皮損中Ki67和CD3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況檢測

免疫熒光染色法觀察各組小鼠皮損中Ki67表達(dá)情況，空白對照組小鼠Ki67表達(dá)于基底層細(xì)胞，見圖6A；模型組小鼠Ki67在基底層和顆粒層均有表達(dá)，其陽性細(xì)胞數(shù)量較空白對照組顯著增多(P<0.01)；甲氨蝶呤組和逍遙散各劑量組小鼠陽性細(xì)胞數(shù)量均較模型組顯著減少(P<0.01)；逍遙散中劑量組陽性細(xì)胞數(shù)量顯著少于甲氨蝶呤組(P<0.05)，見圖6、表2。

Figure 5.Comparison of epidermal thickness between each group on day 9 after modeling. Mean±SD.n=6.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group.

圖5 各組小鼠造模第9天時的表皮厚度比較

Figure 6.The expression of Ki67 in skin of mice in each group (IF). Blue: DAPI; Green: Alexa Fluor488. A: control; B: model; C: MTX; D: XH; E: XM; F: XL.

圖6 各組小鼠皮膚中Ki67的表達(dá)情況

表2 各組小鼠皮膚皮損中Ki67及CD3陽性細(xì)胞數(shù)量

Table 2.The number of Ki67 and CD3 positive cells in skin lesions of mice in each group (Number. Mean±SD.n=6)

GroupKi67CD3Control3.6±0.54.3±0.3Model65.3±3.0##22.40±1.6##MTX40.5±3.2##??9.9±0.4##??XH38.9±1.7##??10.5±0.6##??XM30.8±1.6##??△10.6±0.6##??XL41.7±1.6##??10.1±0.5##??

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel;△P<0.05vsMTX group.

免疫組織化學(xué)染色法觀察各組小鼠皮損中真皮層CD3陽性T細(xì)胞浸潤情況，空白對照組小鼠真皮層CD3陽性細(xì)胞數(shù)量較少，模型組小鼠較空白對照組CD3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P<0.01)，甲氨蝶呤組和逍遙散各劑量組小鼠皮膚組織中CD3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著少于模型組(P<0.01)，見圖7、表2。

6 糖水偏好實驗

糖水偏好實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠糖水偏愛率顯著低于空白對照組小鼠(P<0.01)，甲氨蝶呤組和逍遙散各劑量組小鼠糖水偏愛率較模型組小鼠有一定升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖8。

7 小鼠海馬和下丘腦組織中多巴胺(dopamine,DA)、3,4-二羥基苯乙酸(3,4-Dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC)、高香草酸(homovanillic acid,HVA)和腎上腺素(adrenaline,AD)等神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化

液相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組海馬區(qū)腦組織中DOPAC、谷氨酸(glutamate,Glu)、AD和γ-氨基丁酸(γ-aminobutylic acid,GABA)含量顯著降低(P<0.05)，DA和HVA的含量無顯著差異(P>0.05)；與空白對照組相比，甲氨蝶呤組海馬區(qū)腦組織中DA、AD、DOPAC和GLU含量顯著降低(P<0.05)，見表3。

與空白對照組小鼠相比，模型組下丘腦區(qū)腦組織AD和GABA的含量顯著降低(P<0.05)，DA、DOPAC、HVA和GLU的含量無顯著差異(P>0.05)；甲氨蝶呤組下丘腦區(qū)腦組織GABA含量明顯低于空白對照組(P<0.01)，逍遙散高劑量組下丘腦區(qū)腦組織AD的含量較模型組顯著增多(P<0.01)，逍遙散低劑量組下丘腦區(qū)腦組織HVA的含量較模型組顯著增多(P<0.01)，見表4。

Figure 7.Expression of CD3 positive cells in the skin of mice in each group(IHC). A: control; B: model; C: MTX; D: XH; E: XM; F: XL.

圖7 各組小鼠皮膚中CD3陽性細(xì)胞表達(dá)情況

Figure 8.The sugar water preference rate of each group on the seventh day after modeling. Mean±SD.n=5.##P<0.01vscontrol group.

圖8 造模第7天時各組小鼠的糖水偏好率

8 PASI評分與小鼠海馬和下丘腦區(qū)腦組織中DA、DOPAC、HVA和AD等含量的相關(guān)性分析

DA、DOPAC、HVA和AD等計量資料均呈正態(tài)分布，采用雙變量相關(guān)分析統(tǒng)計其各自與PASI評分的相關(guān)性，結(jié)果顯示，PASI評分與海馬區(qū)腦組織DOPAC、AD、GLU和GABA的含量呈負(fù)相關(guān)，與下丘腦區(qū)腦組織AD、GLU和GABA的含量也呈負(fù)相關(guān)，即PASI評分越高，小鼠背部皮損越重，抑郁相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)量越低，表明小鼠抑郁程度越高。海馬區(qū)腦組織DA、HVA含量，下丘腦區(qū)腦組織DA、DOPAC和HVA含量與PASI評分無相關(guān)性(P>0.05)，見圖9、10。

表3 各組小鼠海馬區(qū)腦組織神經(jīng)遞質(zhì)含量

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group.

表4 各組小鼠下丘腦區(qū)腦組織神經(jīng)遞質(zhì)含量

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group.

Figure 9.Scatter plot of the relationship between DA, DOPAC, HVA, AD, Glu, GABA and PASI score in the hippocampus.

圖9 海馬區(qū)腦組織DA、DOPAC、HVA、Glu、GABA和AD等神經(jīng)遞質(zhì)含量與PASI評分關(guān)系散點圖

討 論

中醫(yī)藥在治療銀屑病等皮膚疾病中積累了豐富的臨床經(jīng)驗，形成了完整的辨證論治體系，具有一定優(yōu)勢。中醫(yī)認(rèn)為銀屑病屬于情志疾病，與“心”、“肝”最為密切[12]，肝主疏泄，藏血，在體合筋,其華在爪；若肝失疏泄，氣機不暢，久郁化火，熱毒壅絡(luò)，則發(fā)紅斑，顏色鮮紅，搔抓皮損有篩狀出血；肝不藏血，血無法營養(yǎng)滋潤腠理，所以有肌膚干燥脫屑、鱗屑疊起，瘙癢等癥；肝血虛，爪甲不榮，而出現(xiàn)指甲頂針樣改變[13]。銀屑病遷延不愈，給患者造成心身打擊，情志失調(diào)反過來亦可影響肝的生理功能，形成惡性循環(huán)。逍遙散源于宋《太平惠民和劑局方》，其藥味配伍，既補肝體，又助肝用，氣血兼顧，達(dá)到疏肝解郁、養(yǎng)血健脾之效，可針對銀屑病肝失疏泄、肝血失養(yǎng)等病機。

實驗結(jié)果顯示，逍遙散可改善銀屑病樣小鼠皮損，降低PASI評分及表皮厚度，減少表皮細(xì)胞增殖，角化不全和T細(xì)胞浸潤。此外通過小鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量變化和糖水偏好實驗，觀察小鼠抑郁狀態(tài)，實驗小鼠取材時間為第9天，空白對照組與模型組小鼠行為學(xué)結(jié)果產(chǎn)生差異后進(jìn)行取材。糖水偏好實驗是基于小鼠對甜味偏好這一特點，可評價實驗動物抑郁樣行為及抗抑郁藥物治療效果，當(dāng)小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為時，其對糖水的偏嗜度也隨之降低[14]。實驗表明，逍遙散可提高小鼠糖水偏好率。除此之外，我們采用HPLC-MS技術(shù)，分析各組小鼠腦組織海馬區(qū)和下丘腦區(qū)AD、GABA和GLU等反應(yīng)抑郁程度的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。海馬和下丘腦區(qū)是應(yīng)激反應(yīng)作用靶區(qū)，參與情緒反應(yīng)，抑郁癥相關(guān)研究多集中于這2個腦區(qū)。結(jié)果顯示空白對照組神經(jīng)遞質(zhì)含量顯著高于模型組和甲氨蝶呤組，逍遙散可顯著提高下丘腦區(qū)AD和HVA的含量，其余神經(jīng)遞質(zhì)有一定升高趨勢，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果顯示出此聯(lián)系后，我們進(jìn)一步研究了銀屑病與抑郁相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的相關(guān)性分析，結(jié)果表明PASI評分與海馬區(qū)DOPAC、AD、GLU和GABA的含量呈負(fù)相關(guān)，與下丘腦區(qū)AD、GLU和GABA的含量也呈負(fù)相關(guān)，即PASI評分越高，小鼠背部皮損越重，抑郁相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)量越低，提示小鼠抑郁程度越高。

Figure 10.Scatter plot of the relationship between DA, DOPAC, HVA, AD, Glu, GABA and PASI score in the in hypothalamus.

圖10 下丘腦區(qū)腦組織DA、DOPAC、HVA、Glu、GABA和AD等神經(jīng)遞質(zhì)含量與PASI評分關(guān)系散點圖

綜上所述，逍遙散可有效緩解小鼠銀屑病樣皮損，在一定程度上可減輕其抑郁程度，銀屑病發(fā)病機制與抑郁癥相互作用靶點，還有待進(jìn)一步探究。