李 敏， 黃婷婷， 姜雙燕， 楊 洋， 陳莎莎， 張文佳， 趙麗娟

(1錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院， 遼寧 錦州 121001; 2燕達醫(yī)院消化內(nèi)科， 北京 101601;3錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化科， 遼寧 錦州 121000)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver di-sease，NAFLD)是全球最常見的慢性肝病之一，成人患病率介于6.3%～45%，其中10%～30%可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)[1]。NASH是全球范圍內(nèi)較為嚴重的一種NAFLD病理類型[2]，發(fā)展成為肝纖維化、肝硬化等的風(fēng)險性大。Herbert等[3]提出的“多重平行打擊”認為NASH是多種機制共同作用的結(jié)果，較為準確地解釋了NASH的發(fā)病機制，提出包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、細胞凋亡、自噬、相關(guān)脂肪因子紊亂和腸道菌群因素等在內(nèi)的多種因素參與了其發(fā)病過程。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種跨膜蛋白，隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤及非折疊蛋白量的積累，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)從PERK上脫離下來，大量PERK通過自身磷酸化被激活，空出的GRP78過表達還會進一步促進PERK的激活[4]。激活的PERK使得真核細胞翻譯起始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α,eIF-2α)第51位的絲氨酸磷酸化，使其磷酸化而被激活[5-7]。正常情況下，eIF-2α無磷酸化，活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4, ATF4)上游5’端存在抑制ATF4翻譯的特定區(qū)域；只有當(dāng)eIF-2α磷酸化時才可直接翻譯ATF4。ATF4下游是轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白[CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein, CHOP]，是ERS引發(fā)凋亡的信號。研究表明NASH的發(fā)病過程中，大量的游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并通過PERK-eIF-2α-ATF4-CHOP通路導(dǎo)致肝細胞發(fā)生凋亡壞死[8],這條通路中GRP78和CHOP被認為是其中重要的標志性信號[9]。

由于NASH發(fā)病機制極其復(fù)雜，臨床至今仍缺乏針對其發(fā)病機制的藥物。研究表明，姜黃素(curcumin)能抑制肝細胞凋亡來減輕肝臟損傷[10]，同時過度的ERS參與了肝細胞凋亡的發(fā)生[9]。目前姜黃素的肝臟保護作用是否與ERS有關(guān)鮮有報道[11]。本項工作主要通過分子生物學(xué)的方法，探討姜黃素對ERS誘導(dǎo)的NASH大鼠肝細胞的保護作用是否與抑制ERS中的PERK通路有關(guān)，為臨床上NASH的治療提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物

選取SPF級6周齡SD雄性大鼠30只，體重(200±10) g，購自錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號為SCXK(遼)2017-0003。

2 主要試劑

普通飼料：由錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；高脂食物組成：79.5%玉米面(糧食雜貨店)+0.5%膽固醇(河南萬邦實業(yè)有限公司，批號：2017031625)+20%豬油(糧食雜貨店)；姜黃素(上海瑞永生物科技有限公司)；甲醛溶液(沈陽天罡化學(xué)試劑廠)；抗GRP78和CHOP抗體(沈陽萬類生物有限公司)；PVDF膜(Millipore)；SDS-PAGE凝膠(武漢博士德生物有限公司)。

3 主要方法

3.1建立模型 30只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機分為3組，分別為正常對照(normal control)組(n=10)、模型(model)組(n=10)及姜黃素(curcumin)組(n=10)。各組均行普通飼料喂養(yǎng)，模型組與姜黃素組在普通飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上予高脂食物(3 ml·kg-1·d-1)灌胃4周，正常組予等量生理鹽水灌胃，喂養(yǎng)4周后，每組隨機處死2只大鼠，留取血液行肝功能檢測、肝組織行病理學(xué)檢測。觀察到模型組及姜黃素組大鼠丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine ami-notransferase, ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate ami-notransferase, AST)較正常對照組顯著升高，同時，光鏡下可見明顯肝細胞脂肪變性及大量炎細胞浸潤，造模成功[11]。

3.2藥物干預(yù) 從第5周開始，在喂養(yǎng)方法不變基礎(chǔ)上，姜黃素組給予姜黃素灌胃，給藥劑量為200 mg·kg-1·d-1，模型組與正常對照組予等量生理鹽水灌胃，灌胃4周，第8周末結(jié)束實驗。稱重，禁食12 h后麻醉，解剖，采心臟血，檢測ALT和AST；迅速取出肝臟并稱重，取部分肝臟組織制作石蠟切片，另一部分肝臟組織至于-80 ℃冰箱中用于制作肝組織勻漿。

3.3檢測方法 (1)生化檢測：全自動生物化學(xué)分析儀檢測ALT和AST水平；(2)病理組織學(xué)：制作石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀察肝臟脂肪變性及炎癥程度；(3)Western blot檢測：精確稱取相同部位的肝臟組織300 mg，制備肝組織勻漿，檢測GRP78和CHOP蛋白的表達；(4)TUNEL法檢測細胞凋亡：按試劑盒說明書操作。細胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒者為陽性細胞。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

SPSS 21.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)來表示，計數(shù)資料比較經(jīng)正態(tài)分布檢驗，采用兩組獨立樣本t檢驗分析。以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，病理形態(tài)學(xué)結(jié)果用對比描述方法分析。

結(jié) 果

1 各組大鼠血生化相關(guān)指標(ALT和AST)變化

第4周末，模型組和姜黃素組分別與正常對照組對比，大鼠血清ALT和AST均升高(P<0.05)。實驗結(jié)束時，與正常對照組相比，模型組大鼠血清ALT和AST顯著升高，姜黃素組大鼠血清ALT和AST與模型組比較顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 肝功指標的變化

*P<0.05，**P<0.05vsnormal control group；#P<0.05，##P<0.05vsmodel group.

2 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化

第4周末，模型組和姜黃素組大鼠較正常對照組肝細胞胞質(zhì)內(nèi)見脂肪滴，炎癥細胞明顯增多，結(jié)合生化指標結(jié)果，提示造模成功，見圖1；第8周末，正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，肝細胞大小、形態(tài)規(guī)則；模型組大鼠肝小葉邊界模糊，肝索排列紊亂，可見炎癥細胞浸潤，肝細胞體積明顯增大，胞質(zhì)內(nèi)可見大泡性脂肪滴；姜黃素組大鼠肝細胞脂肪變性及炎性程度均明顯減輕，未見明顯壞死灶，見圖2。

Figure 1.Pathological results for rat liver at the end of the 4th week (HE staining). A: normal control group; B: model group. Red arrow: fat drop; black arrow: inflammatory cell infiltration.

圖1 第4周末各組大鼠肝臟病理學(xué)結(jié)果

Figure 2.Pathological results for rat liver at the end of the 8th week (HE staining). A: normal control group; B: model group; C: curcumin group. Red arrow: fat drop; black arrow: inflammatory cell infiltration.

圖2 第8周末各組大鼠肝臟病理學(xué)結(jié)果

3 各組大鼠肝組織相關(guān)蛋白表達

Western blot檢測肝組織ERS相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的表達，得到相應(yīng)條帶，可見：模型組較正常對照組GRP78和CHOP表達顯著上調(diào)，姜黃素組較模型組CRP78和CHOP表達顯著下調(diào) (P<0.01)，見圖3。

Figure 3. The expression levels of GRP78 and CHOP in liver tissues of rats in each group. Mean±SD.n=8.##P<0.01vsnormal control group;**P<0.05vsmodel group.

圖3 各組大鼠CRP78和CHOP的表達變化

4 各組大鼠肝細胞凋亡情況

正常對照組大鼠肝細胞可見極少凋亡細胞，模型組凋亡細胞增多；姜黃素組大鼠的凋亡肝細胞較模型組減少，見圖4。

討 論

NASH的發(fā)病機制仍不十分明確，被廣泛接受的是“二次打擊”學(xué)說，即脂類在肝細胞沉積為第1次打擊過程，由此引發(fā)的一系列細胞毒性反應(yīng)為第2次打擊[12-13]，進一步導(dǎo)致肝臟損傷。目前研究表明，NASH的發(fā)病過程是多因素共同作用的結(jié)果，過度的ERS能造成肝細胞功能失調(diào)，誘發(fā)肝細胞凋亡的發(fā)生[14]，而肝細胞凋亡可被游離脂肪酸誘導(dǎo)引起脂肪代謝紊亂并進一步誘發(fā)ERS，最終導(dǎo)致NASH的出現(xiàn)[15-17]。GRP78是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上輔助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽形成正確構(gòu)象的蛋白，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊及錯誤折疊蛋白蓄積增加時，GRP78蛋白與PERK分離[15]，表達上調(diào)，故被認為是ERS啟動信號，這為臨床判斷肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激狀態(tài)提供了思路，即檢測GRP78蛋白表達水平高低[18]。CHOP存在于細胞質(zhì)中，在ERS激活時而轉(zhuǎn)至細胞核，通過下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2以及上調(diào)促凋亡成員Bim的表達促進細胞凋亡，因此被認為是ERS最主要的凋亡因子。

本研究采用高脂飲食構(gòu)建NASH模型，顯示模型組ALT和AST高于正常對照組，并出現(xiàn)了肝細胞脂肪變性和炎癥因子浸潤，凋亡細胞明顯增多，提示造模成功；而經(jīng)姜黃素治療后，肝細胞脂肪變性、炎癥細胞浸潤及肝細胞凋亡程度、以及肝功能(ALT和AST)均顯著下降，提示姜黃素對NASH大鼠肝臟具有保護作用。姜黃素是從植物姜黃中提取的有效物質(zhì)，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤和抗纖維化等藥理作用[19]；姜黃素可減輕衣霉素誘導(dǎo)ERS引起的肝損傷[20]，同時能夠清除自由基，防止脂質(zhì)過氧化。隨著臨床對姜黃素的抗腫瘤作用的持續(xù)關(guān)注和深入，有研究指出姜黃素能夠通過ERS途徑誘導(dǎo)癌細胞的細胞周期阻滯和凋亡，抑制癌細胞活性[21]。姜黃素可通過CHOP途徑抑制肝癌細胞增值，其增殖抑制作用與藥物濃度及作用時間有關(guān)[22]。而本研究結(jié)果也證實模型組大鼠GRP78及CHOP蛋白的表達較正常對照組均增高，說明NASH大鼠肝細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并誘導(dǎo)產(chǎn)生肝細胞凋亡；姜黃素組大鼠GRP78和CHOP蛋白的表達降低。由此可見，姜黃素可通過下調(diào)GRP78和CHOP表達抑制ERS發(fā)生，從而減輕肝細胞凋亡，發(fā)揮保護肝臟的作用。

Figure 4.Results for hepatocyte apoptosis.A: normal control group; B: model group; C: curcumin group. Black arrow: apoptotic cells.

圖4 肝細胞凋亡結(jié)果

綜上所述，姜黃素能改善NASH大鼠肝功能、減輕其病理學(xué)改變、減輕肝細胞凋亡的生理作用可能與其抑制ERS有關(guān)，為臨床應(yīng)用姜黃素治療NASH提供了依據(jù)。但因本研究樣本量有限，需要擴大樣本量進一步研究。