姚賢鳳， 鄭開金， 陳 梅， 王利民

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，貴州 貴陽 550002)

年齡相關(guān)性黃斑病變等眼底疾病是常見的危害人類生命健康的疾病；這些眼底疾病的發(fā)生與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能障礙和損傷有關(guān)；視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞對(duì)于視色素合成、收散色光線等均具有重要意義；氧化應(yīng)激是常見的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)因素之一，是由細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基引起的[1-2]。洋蔥總黃酮(total flavonoids of onion，F(xiàn)O)是從洋蔥中提取出來的活性成分，具有多種生物學(xué)作用，目前已知其具有抗腫瘤、改善糖尿病視網(wǎng)膜病變和神經(jīng)保護(hù)等作用[3-5]。有研究表明，洋蔥總黃酮處理后糖尿病視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞凋亡減少，組織中氧化應(yīng)激水平降低，洋蔥總黃酮具有抗氧化應(yīng)激的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)用過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)處理視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，探討洋蔥總黃酮對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞以含有10%胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱。H2O2購自Sigma；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平檢測(cè)試劑盒購自Molecular Devices；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒和丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；抗細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗體購自Abcam；抗活化型caspase-3(cleaved caspase-3)和活化型caspase-9(cleaved caspase-9)抗體購自Abbkine；洋蔥總黃酮由貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室提取保存。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組處理 將ARPE-19細(xì)胞分為對(duì)照(control)組、H2O2組、低濃度FO處理+H2O2(low concentration of FO+H2O2,FO-L+H2O2)組、中濃度FO處理+H2O2(medium concentration of FO+H2O2,FO-L+H2O2)組和高濃度FO+H2O2(high concentration of FO+H2O2，F(xiàn)O-H+H2O2)組。處理方法如下：control組用含有0 mg/L洋蔥總黃酮和0 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；H2O2組用含有0 mg/L洋蔥總黃酮和200 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；FO-L+H2O2組用含有30 mg/L洋蔥總黃酮和200 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；FO-M+H2O2組用含有60 mg/L洋蔥總黃酮和200 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；FO-H+H2O2組用含有90 mg/L洋蔥總黃酮和200 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 調(diào)整ARPE-19細(xì)胞密度為2.5×107/L，種植到96孔板中，每個(gè)孔中添加100 μL的細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)過夜后，按照control、H2O2、FO-L+H2O2、FO-M+H2O2和FO-H+H2O2分組處理。24 h后，終止培養(yǎng)，在每個(gè)孔中添加20 μL的MTT溶液，繼續(xù)孵育培養(yǎng)4 h。將孔內(nèi)的液體吸棄，添加150 μL的DMSO溶液，置于搖床上孵育5 min。在590 nm的分光光度儀上檢測(cè)吸光度(A)值，經(jīng)過空白孔調(diào)零以后，設(shè)置control組細(xì)胞存活率為100%，分析其余各組細(xì)胞存活率。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞分組處理培養(yǎng)24 h后，用PBS將細(xì)胞懸浮以后，在細(xì)胞中添加結(jié)合緩沖液100 μL，孵育15 min以后，繼續(xù)添加10 μL的PI和5 μL的annexin V-FITC。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.4DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平 ARPE-19細(xì)胞接種到24孔板中，按照control、H2O2、FO-L+H2O2、FO-M+H2O2和FO-H+H2O2分組處理。培養(yǎng)24 h后，在細(xì)胞中添加DCFH-DA染液，用熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度表示ROS水平。

2.5細(xì)胞中SOD活性和MDA含量的檢測(cè) 各組細(xì)胞分組處理培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中SOD活性和MDA含量，SOD檢測(cè)用WST法，MDA含量檢測(cè)用TBA法，步驟均遵循試劑盒說明書。

2.6JC-1法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位 各組細(xì)胞分組處理培養(yǎng)24 h后，在細(xì)胞中添加濃度為2 mg/L的JC-1染液孵育培養(yǎng)30 min以后，在細(xì)胞中添加細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次以后，以細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞以后，分別檢測(cè)485 nm激發(fā)波長(zhǎng)及535 nm和590 nm發(fā)射波長(zhǎng)下紅綠熒光比值，以紅綠熒光比值表示線粒體膜電位。

2.7Western blot檢測(cè)胞質(zhì)中Cyt C蛋白水平及細(xì)胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平 各組細(xì)胞分組處理培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，按照試劑盒提取細(xì)胞質(zhì)中的總蛋白，同時(shí)提取細(xì)胞中總蛋白。按照下述方法進(jìn)行Western blot檢測(cè)：用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，吸取蛋白樣品添加至5×上樣緩沖液混合(二者體積比為4 ∶1)。在電泳槽內(nèi)添加電泳液，采用10% SDS-PAGE，每個(gè)泳道中上樣量為30 μg，marker上樣量為5 μL，以80 V的電壓電泳30 min，調(diào)整電壓至120 V繼續(xù)電泳，直到溴酚藍(lán)染料進(jìn)入到底部以后，停止電泳。按照常規(guī)半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)膜參數(shù)：120 mA，90 min)。取出電轉(zhuǎn)結(jié)束后的NC膜，放在含有5%牛血清白蛋白封閉液的平皿內(nèi)孵育結(jié)合1.5 h。將NC膜取出，置于含有 I 抗的反應(yīng)液中在4 ℃結(jié)合過夜，再與 II 抗(1 ∶2 000稀釋)置于室溫中孵育1.5 h后，用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，以Quantity One分析蛋白的光密度值，β-actin作為參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 21.0軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組差異比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 洋蔥總黃酮提高過氧化氫作用下視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞的活力

與control組比較，H2O2組的ARPE-19細(xì)胞活力顯著降低；與H2O2組比較，F(xiàn)O-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組的細(xì)胞活力顯著升高；FO-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組的細(xì)胞活力逐漸升高(P<0.05)，見表1。

表1 洋蔥總黃酮處理對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞活力、凋亡和ROS生成的影響

Table 1.The effects of total flavonoids of onion (FO) on H2O2-induced cell viability, apoptosis and ROS production of retinal pigment epithelial ARPE-19 cells (Mean±SD.n=3)

GroupCell viability (%)Apoptosis (%)ROS (MFI)Control100.006.30±0.20215.42±26.45H2O232.58±5.51?24.50±0.70?608.97±30.68?FO-L+H2O251.20±4.02?△17.73±0.51?△511.79±40.65?△FO-M+H2O273.95±6.36?△○13.03±0.90?△○442.83±28.71?△○FO-H+H2O285.24±7.13?△○&10.70±0.36?△○&305.28±30.19?△○&

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsH2O2group;○P<0.05 vs FO-L+H2O2group;&P<0.05vsFO-M+H2O2group.

2 洋蔥總黃酮減少過氧化氫作用下視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞凋亡

與control組比較，H2O2組的細(xì)胞凋亡率升高；與H2O2組比較，F(xiàn)O-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組的細(xì)胞凋亡率降低；FO-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組的細(xì)胞凋亡率逐漸降低(P<0.05)，見圖1和表1。

Figure 1.The images of flow cytometry for analyzing the effect of total flavonoids of onion (FO) on hydrogen peroxide (H2O2)-induced apoptosis of retinal pigment epithelial ARPE-19 cells.

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)洋蔥總黃酮處理對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞凋亡的影響

3 洋蔥總黃酮減少過氧化氫作用下視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞中ROS的生成

與control組比較，H2O2組的細(xì)胞中ROS水平升高；與H2O2組比較，F(xiàn)O-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組的細(xì)胞中ROS水平降低；FO-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組的細(xì)胞中ROS水平逐漸降低，見表1。

4 洋蔥總黃酮減少過氧化氫作用下視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞中MDA含量并提高SOD活性

與control組比較，H2O2組的細(xì)胞中MDA水平升高，SOD活性降低；與H2O2組比較，F(xiàn)O-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組的細(xì)胞中MDA水平降低，SOD活性升高；FO-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組的細(xì)胞中MDA水平逐漸降低，SOD活性逐漸升高，見表2。

表2 洋蔥總黃酮處理對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞中SOD活性、MDA水平及線粒體膜電位的影響

Table 2.The effects of total flavonoids of onion (FO) on the levels of SOD, MDA and mitochondrial membrane potential in H2O2-induced retinal pigment epithelial ARPE-19 cells (Mean±SD.n=3)

GroupSOD (U/g)MDA (μmol/g)Mitochondrial membrane potentialControl56.62±4.201.54±0.134.36±0.10H2O230.15±2.16?2.86±0.12?2.03±0.12?FO-L+H2O235.36±1.42?△2.37±0.16?△2.65±0.11?△FO-M+H2O240.91±2.48?△○2.07±0.10?△○3.12±0.15?△○FO-H+H2O246.12±3.21?△○&1.81±0.12?△○&3.74±0.21?△○&

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsH2O2group;○P<0.05vsFO-L+H2O2group;&P<0.05vsFO-M+H2O2group.

5 洋蔥總黃酮提高過氧化氫條件下視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞線粒體膜電位并減少胞質(zhì)中Cyt C的蛋白水平

與control組比較，H2O2組的細(xì)胞線粒體膜電位降低，胞質(zhì)中Cyt C的蛋白水平升高；與H2O2組比較，F(xiàn)O-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組細(xì)胞質(zhì)中Cyt C蛋白水平降低，線粒體膜電位升高；FO-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組細(xì)胞質(zhì)中Cyt C蛋白水平逐漸降低，線粒體膜電位逐漸升高(P<0.05)，見圖2、表2和表3。

Figure 2.The images of Western blot for determining the effects of total flavonoids of onion (FO) on the protein levels of Cyt C in the cytoplasm, and cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 in the retinal pigment epithelial ARPE-19 cells induced by H2O2.

圖2 Western blot檢測(cè)洋蔥總黃酮處理對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞胞質(zhì)中Cyt C及細(xì)胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平的影響

6 洋蔥總黃酮減少過氧化氫作用下視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平

與control組比較，H2O2組細(xì)胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平升高；與H2O2組比較，F(xiàn)O-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組細(xì)胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平降低；FO-L+H2O2組、FO-M+H2O2組和FO-H+H2O2組細(xì)胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平逐漸降低(P<0.05),見圖2、表3。

討 論

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷是常見眼底病發(fā)生的主要原因，生理狀態(tài)下的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是血-視網(wǎng)膜屏障的重要組成部分，對(duì)光感受器的更新及視色素合成等具有重要意義[7]。氧化損傷是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能障礙的主要原因，氧化應(yīng)激能夠抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[8-10]。本實(shí)驗(yàn)用過氧化氫處理視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率升高，說明成功構(gòu)建了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷模型。

表3 洋蔥總黃酮處理對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞胞質(zhì)中Cyt C及細(xì)胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平影響

Table 3.The effects of total flavonoids of onion (FO) on the protein levels of Cyt C in the cytoplasm, and cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 in retinal pigment epithelial ARPE-19 cells induced by H2O2(Mean±SD.n=3)

GroupCyt C Cleaved caspase-3Cleaved caspase-9Control0.13±0.020.10±0.030.15±0.01H2O20.69±0.07?0.39±0.05?0.58±0.06?FO-L+H2O20.51±0.04?△0.31±0.02?△0.41±0.03?△FO-M+H2O20.36±0.06?△○0.23±0.01?△○0.30±0.04?△○FO-H+H2O20.23±0.02?△○&0.17±0.02?△○&0.23±0.01?△○&

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsH2O2group;○P<0.05vsFO-L+H2O2group;&P<0.05vsFO-M+H2O2group.

洋蔥總黃酮是從洋蔥中提取出來的活性成分，洋蔥屬于百合科草本植物，是一種家常蔬菜，洋蔥具有降血壓、防腫瘤和消炎等作用[11]。自然界中的大多數(shù)植物中均含有黃酮類化合物，并且多以苷類存在[12]。目前的研究顯示，洋蔥總黃酮對(duì)于視網(wǎng)膜損傷具有改善作用，其可以抑制視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞凋亡發(fā)生，抑制視網(wǎng)膜組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，高中低劑量的洋蔥總黃酮處理可以減少過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞的活力，洋蔥總黃酮具有抗視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用，洋蔥總黃酮抗氧化應(yīng)激作用可能具有濃度依賴性。

過往研究報(bào)道已經(jīng)顯示，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，其可以通過促進(jìn)細(xì)胞中線粒體釋放Cyt C誘導(dǎo)細(xì)胞中caspase凋亡反應(yīng)的發(fā)生，而線粒體釋放Cyt C與細(xì)胞線粒體膜電位下降有關(guān)[13-16]。caspase是一個(gè)與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白家族，其可以被胞質(zhì)中的Cyt C激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[17]。caspase-9是細(xì)胞凋亡的上游激活因子，其可以被釋放至胞質(zhì)中的Cyt C激活，從而誘導(dǎo)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，最終激活下游效應(yīng)因子caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[18]。氧化應(yīng)激的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)障礙有關(guān)，抗氧化酶是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，其活性降低可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧自由基積累[19]。生理狀態(tài)下的氧自由基具有維持細(xì)胞氧化平衡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用，而病理狀態(tài)下過量的氧自由基可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生過氧化，生成大量的MDA[20]。SOD是氧自由基的清除劑，其活性降低可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞中ROS積累，誘導(dǎo)氧化損傷[21]。本實(shí)驗(yàn)用洋蔥總黃酮處理過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，細(xì)胞中ROS水平降低，SOD活性升高，細(xì)胞合成的MDA含量下降，洋蔥總黃酮可以抑制過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還顯示，高中低劑量的洋蔥總黃酮處理還可以提高視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞線粒體膜電位，減少胞質(zhì)中Cyt C積累，抑制細(xì)胞中caspase-3和caspase-9的活化，提示洋蔥總黃酮可能能夠呈濃度依賴性的通過ROS/Cyt C/caspase抑制過氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷。

總之，洋蔥總黃酮具有抗視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷的作用，其可以降低細(xì)胞氧化損傷，減少線粒體釋放Cyt C，抑制caspase凋亡反應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在30、60和90 mg/L的洋蔥總黃酮?jiǎng)┝糠秶鷥?nèi)，其可以呈濃度依賴性的減輕氧化氫誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化損傷，本次實(shí)驗(yàn)只是初步探討不同濃度的洋蔥總黃酮的作用，在今后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)考慮繼續(xù)摸索“最佳劑量”，研究洋蔥總黃酮的劑量效應(yīng)。洋蔥總黃酮可能是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的治療的潛在途徑。