郝 偉， 左東澤， 張俊秀， 蔣莉莉， 熊 鶯， 李先偉， 楊解人△

(1皖南醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心, 2皖南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種主要累及肺間質(zhì)、肺泡和(或) 細(xì)支氣管的肺部彌漫性疾病，肺泡-毛細(xì)血管功能單位逐漸喪失，最終發(fā)展為彌漫性肺纖維化和蜂窩肺，其發(fā)病率高，預(yù)后差，缺乏可靠的治療方法[1]。肺纖維化的典型特征是肺組織內(nèi)大量成纖維細(xì)胞聚集，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和損傷。研究表明，肺泡上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，即上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)進(jìn)程是成纖維細(xì)胞的重要來(lái)源[2]。因此，抑制EMT進(jìn)程對(duì)防治肺纖維化具有重要意義。

目前臨床上治療肺纖維化的藥物主要以皮質(zhì)類固醇類和其它免疫抑制劑為主，但這些藥物僅對(duì)部分肺纖維化患者有效，因此，尋找有效的藥物治療肺纖維化尤為重要。

二甲雙胍是一種成熟且廣泛使用的口服降糖藥，并因其潛在的抗腫瘤作用而受到關(guān)注。 最近的報(bào)道也證明了其在抑制EMT和纖維化中的作用，此外，二甲雙胍還可以通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)改善吉非替尼誘導(dǎo)的肺纖維化[3]。但是二甲雙胍是否可以通過(guò)抑制TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制肺纖維化過(guò)程中的EMT，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究以博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠為研究對(duì)象，以TGF-β1轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討二甲雙胍能否通過(guò)抑制肺泡EMT進(jìn)程來(lái)減輕肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展，從而為臨床用藥提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性8周齡Sprague-Dawley (SD)大鼠48只，體重180～220 g，許可證號(hào)為SCXK(浙)2014-0001，購(gòu)于南京市江寧區(qū)南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。

2 主要試劑

鹽酸二甲雙胍片(批號(hào)：48150513)購(gòu)于上海信誼藥廠有限公司；注射用鹽酸博來(lái)霉素(批號(hào)：15042611)購(gòu)于海正輝瑞制藥有限公司；Masson染色試劑盒(批號(hào)：20160406)購(gòu)于南京建成生物技術(shù)研究所；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒(編號(hào)：PA110)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司； PCR引物設(shè)計(jì)合成(上海生工)；TRIzol RNA提取試劑盒(批號(hào)：P4907)購(gòu)于Invitrogen;熒光定量PCR試劑盒(批號(hào)：AH80230A)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：AK6301)購(gòu)于日本TaKaRa公司；GAPDH小鼠抗大鼠IgG(編號(hào)：AF0006)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(編號(hào)：A0216)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(編號(hào)：A0208)和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(編號(hào)：P0012S)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；小鼠抗大鼠TGF-β1單克隆抗體(批號(hào)：1714116)購(gòu)于博士德公司；兔抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)多克隆抗體(批號(hào)：GR244953-1)、兔抗大鼠collagen I(批號(hào)：GR214135-1)及collagen III多克隆抗體(批號(hào)：GR245245-1)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；小鼠抗大鼠波形蛋白(vimentin)單克隆抗體(批號(hào)：B1914)、兔抗大鼠上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(批號(hào)：K0614)和大鼠抗大鼠緊密連接蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)單克隆抗體(批號(hào)：J0616)購(gòu)于Santa Cruz；小鼠抗大鼠細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)單克隆抗體(批號(hào)：21)及p-ERK1/2單克隆抗體(批號(hào)：17)、兔抗大鼠Smad2/3多克隆抗體(批號(hào)：0003)及p-Smad2/3多克隆抗體(批號(hào)：0006)購(gòu)于Cell Signaling Technology； Luminata Crescendo發(fā)光液(批號(hào)：1702302)和蛋白預(yù)染 marker(批號(hào)：00471191)購(gòu)于Thermo Scientific。

3 主要儀器

BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf)；StepOnePlus Real-Time PCR System(ABI)；Mini PROTEAN電泳系統(tǒng)和Mini PROTEAN轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad)；FluorChem FC3凝膠成像系統(tǒng)(ProteinSimple)；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(Tecan)。

4 方法

4.1肺纖維化大鼠模型的建立[4]48只健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分為對(duì)照(control，n=12)組與模型(model，n=36)組。模型組大鼠用1%的戊巴比妥鈉(0.4 g/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥于手術(shù)臺(tái)，固定好頭部和四肢，常規(guī)消毒后用手術(shù)刀片行頸部正中切一小口，鈍性分離暴露氣管，將注射器刺入大鼠氣管軟骨環(huán)間隙并注入博來(lái)霉素藥液(5 mg/kg)，迅速直立并同時(shí)旋轉(zhuǎn)大鼠，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)。對(duì)照組注入等量生理鹽水。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組(5 mg/kg)、二甲雙胍低劑量(100 mg/kg)組和二甲雙胍高劑量(300 mg/kg)組[5]；治療組于造模后第2天開(kāi)始灌服相應(yīng)劑量的二甲雙胍(100 mg/kg及300 mg/kg)，對(duì)照組及模型組均給予等體積蒸餾水，連續(xù)4周。

4.2肺組織標(biāo)本的采集與處理 給藥4周后，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血處死大鼠。立即打開(kāi)胸腔，經(jīng)右心室用PBS灌流液將肺組織沖洗干凈后，迅速取出，再用預(yù)冷的PBS將其漂洗干凈。稱取100 mg左肺組織置于-80 ℃冰箱保存，用于real-time PCR檢測(cè)。右肺置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于病理學(xué)觀察及免疫組化檢測(cè)。剩余肺組織置于-80℃冰箱保存，用于Western blot檢測(cè)。

4.3病理學(xué)檢查 取右肺組織，4%多聚甲醛固定48 h，乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片(5 μm/片)，依次脫臘、入水，進(jìn)行HE染色和Masson染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察右肺的病理學(xué)變化及膠原沉積情況。 Masson膠原染色按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

4.4免疫組化檢測(cè)右肺TGF-β1蛋白表達(dá) 肺組織石蠟切片，每片約5 μm，依次脫臘、入水，抗原修復(fù)液修復(fù) 15 min ，加封閉液，37 ℃封閉 1 h，加 TGF-β1(1∶150)Ⅰ抗4 ℃過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫1 h，加Ⅱ抗(1∶100)，37 ℃孵育1 h；加SABC，37 ℃孵育2 h；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片觀察，結(jié)果判斷：TGF-β1主要定位于胞漿。陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)成黃至棕黃色顆粒。

4.5Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 用TRIzol等試劑提取組織總 RNA 后 ，核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行 RT反應(yīng)。合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR引物由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成。按TaKaRa 公司的Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 30 s； 95 ℃ 變性5 s，60 ℃ 31 s， 40個(gè)循環(huán)。統(tǒng)計(jì)各組2-ΔΔCt值，計(jì)算相應(yīng)RQ值，比較各組 mRNA的表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 引物序列

4.6Western blot實(shí)驗(yàn) 左肺組織加入RIPA裂解液在冰上勻漿，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。制備10%分離和5%濃縮膠，,每孔上樣50 μg，凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，封閉，分別滴加Ⅰ抗和Ⅱ抗孵育。 洗膜后將高靈敏度Luminata Crescendo 發(fā)光液加到膜的正面，采用FluorChem FC3凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。圖像用ImageJ 1.43軟件進(jìn)行灰度值分析并比較各組蛋白表達(dá)差異。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0軟件。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析及Newman-Keuls-Student多重比較t檢驗(yàn)。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠一般狀況的影響

正常對(duì)照組大鼠精神良好，且無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生；肺纖維化模型組大鼠精神萎靡，在麻醉過(guò)程中有2只死亡，飼養(yǎng)過(guò)程中死亡3只；二甲雙胍低劑量組在麻醉過(guò)程中死亡2只，飼養(yǎng)過(guò)程中死亡3只；二甲雙胍高劑量組在麻醉過(guò)程中死亡1只，飼養(yǎng)過(guò)程中死亡2只。

2 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理改變的影響

HE染色顯示，正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡上皮細(xì)胞完整，未見(jiàn)到成纖維細(xì)胞明顯增生;模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡壁厚度明顯增加，肺泡間隔內(nèi)成纖維細(xì)胞顯著增多，纖維化明顯，且局部實(shí)變;而給予不同劑量的二甲雙胍治療4周后上述病理變化均有不同程度的改善,見(jiàn)圖1。

3 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織膠原沉積的影響

Masson染色顯示正常組大鼠肺組織僅有少量呈藍(lán)染的膠原纖維;模型組大鼠肺組織有大量藍(lán)色深染，膠原纖維沉積增多;而給予不同劑量的二甲雙胍治療4周后肺組織內(nèi)藍(lán)染逐漸減少,見(jiàn)圖2。

4 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織α-SMA和vimentin mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，E-cadherin和ZO-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍低、高劑量組α-SMA和vimentin mRNA及蛋白表達(dá)水平均有不同程度降低，E-cadherin和ZO-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 1.The effect of metformin on the histopathological changes of lung tissues in the rats with pulmonary fibrosis (HE staining). The scale bar=200 μm. A: control group; B: model group; C: metformin (low) group; D: metformin (high) group

圖1 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理改變的影響

Figure 2.The effect of metformin on collagen deposition in lung tissues of the rats with pulmonary fibrosis (Masson staining). The scale bar=200 μm. A: control group; B: model group; C: metformin (low) group; D: metformin (high) group.

圖2 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織膠原沉積的影響

5 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織collagen I表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織collagen I mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍低、高劑量組collagen I mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 3.The effect of metformin on the expression of EMT markers in lung tissues of the rats with pulmonary fibrosis. A: the mRNA expression of EMT markers was determined by real-time PCR; B: the protein expression of EMT markers was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖3 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響

Figure 4.The effect of metformin on the expression of collagen I in lung tissues of the rats with pulmonary fibrosis. A: the mRNA expression of collagen I was determined by real-time PCR; B: the protein expression of collagen I was determined by Western blot. Mean±SD. n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖4 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織collagen I表達(dá)的影響

6 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織collagen III表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織collagen III mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍低、高劑量組collagen III mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖5。

7 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍低、高劑量組TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)水平均有不同程度下降(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖6、7。

Figure 5.The effect of metformin on the expression of collagen III in lung tissues of the rats with pulmonary fibrosis. A: the expression of collagen III mRNA was determined by real-time PCR; B: the expression of collagen III protein was determined by Western blot. Mean±SD. n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖5 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織collagen III表達(dá)的影響

Figure 6.The effect of metformin on the expression of TGF-β1in lung tissues of the rats with pulmonary fibrosis. A: the mRNA expression of TGF-β1was determined by real-time PCR; B: the protein expression of TGF-β1was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖6 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1表達(dá)的影響

8 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織Smad2/3蛋白磷酸化水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織Smad2/3蛋白磷酸化水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍低、高劑量組Smad2/3蛋白磷酸化水平均有不同程度下降(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖8。

9 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織ERK1/2蛋白磷酸化水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織ERK1/2蛋白磷酸化水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍低、高劑量組ERK1/2蛋白磷酸化水平均有不同程度下降(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖9。

Figure 7.The expression of TGF-β1protein in lung tissues of the rats with pulmonary fibrosis was determined with immunohistochemistry staining. The scale bar=200 μm. A: control group; B: model group; C: metformin (low) group; D: metformin (high).

圖7 免疫組化染色檢測(cè)二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1表達(dá)的影響

Figure 8.The effect of metformin on the phosphorylation of Smad2/3 in lung tissues of the rats with pulmonary fibrosis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖8 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織Smad2/3蛋白磷酸化水平的影響

討 論

肺纖維化是一種慢性、漸進(jìn)性、不可逆轉(zhuǎn)的下呼吸道疾病。研究發(fā)現(xiàn)肺泡EMT在PF發(fā)生發(fā)展起著重要作用，vimentin和α-SMA是肺泡EMT過(guò)程中常見(jiàn)的標(biāo)志物，是肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts,MFb)大量聚集的重要特征。MFb的過(guò)量增殖是造成ECM聚集并導(dǎo)致肺纖維化的主要原因[6]。此外，肺泡ECM主要由I、III型膠原組成[7-8]，其可下調(diào)或分解細(xì)胞之間的連接成分，如ZO-1和E-cadherin蛋白[9-10]，E-cadherin蛋白表達(dá)逐漸降低被認(rèn)為是EMT的標(biāo)志[10]。

Figure 9.The effect of metformin on the phosphorylation of ERK1/2 in lung tissues of the rats with pulmonary fibrosis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05;##P<0.01vsmodel group.

圖9 二甲雙胍對(duì)肺纖維化大鼠肺組織ERK1/2蛋白磷酸化水平的影響

二甲雙胍是一種應(yīng)用廣泛且耐受性良好的降糖藥，臨床證據(jù)表明接受二甲雙胍明顯降低糖尿病病人的患癌風(fēng)險(xiǎn)和死亡率，因此，二甲雙胍作為一種潛在的抗癌藥物引起了研究的重視[11-13]。二甲雙胍可以調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的EMT，并顯著下調(diào)多種EMT標(biāo)志物的表達(dá)[14]。

本研究的HE及Masson染色結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡壁厚度明顯增加；膠原沉積增多；表明BLM誘導(dǎo)了肺纖維化。不同劑量的二甲雙胍處理明顯改善肺泡壁厚度，降低肺組織中的膠原沉積；并且二甲雙胍處理促進(jìn)E-cadherin 和ZO-1 表達(dá)，降低α-SMA、vimentin及I、III型膠原表達(dá)，結(jié)果提示二甲雙胍可改善BLM誘導(dǎo)的肺纖維化。

TGF-β1是一種分泌型細(xì)胞因子，其參與組織的纖維化，因此也被認(rèn)為致纖維化因子[15-16]。TGF-β1通過(guò)與膜上的跨膜絲氨酸/蘇氨酸受體相結(jié)合，激活下游的Smad2或Smad3，與Smad4形成三聚體并轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，并與其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合調(diào)節(jié)與EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而使細(xì)胞間連接分散、細(xì)胞骨架重排及細(xì)胞移行和侵襲能力明顯增加，使肺泡EMT[17-18]。此外，TGF-β還可通過(guò)MAPKs通路參與肺泡EMT。MAPKs通路包括ERK1/2、JNK及p38 MAPK信號(hào)通路。其中，ERK1/2信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂及細(xì)胞間功能的同步性等多種生理功能中起著重要作用。ERK1/2信號(hào)通路的激活也參與了TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡EMT，是TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞間緊密跡接的解離和細(xì)胞移動(dòng)的必要條件[19]。ERK和Smad通路之間在肺組織膠原的產(chǎn)生上存在著協(xié)同的作用，它們?cè)诜卫w維化的病程中相互促進(jìn)從而導(dǎo)致了肺纖維化的形成[20-21]。本研究顯示，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中，TGF-β1的表達(dá)明顯上調(diào)，Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯升高。給予不同劑量的二甲雙胍治療4周后，肺纖維化大鼠肺組織中，TGF-β1的表達(dá)明顯下調(diào)，Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯降低，提示二甲雙胍可調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad2/3及TGF-β1/ERK1/2信號(hào)通路。

綜上所述，二甲雙胍可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1信號(hào)而緩解肺纖維化大鼠肺泡EMT的進(jìn)程，進(jìn)而影響肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，其詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。