楊 依， 唐曉麗， 劉 悅， 方 芳

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 北京 102488)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD) 是一種神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率隨年齡增長，臨床表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶減退和認(rèn)知功能障礙，生活自理能力下降，精神人格出現(xiàn)異常等[1]。β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積是AD可能的發(fā)病機(jī)制之一，體內(nèi)外實驗均有研究證明[2-3]，一定劑量以上的Aβ具有神經(jīng)損傷作用，能對動物行為和認(rèn)知功能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致或加速神經(jīng)細(xì)胞凋亡，常用于模擬AD模型。生物體內(nèi)Aβ的生成、代謝降解過程都與細(xì)胞自噬密切相關(guān)[4]。正常生理狀態(tài)下，經(jīng)自噬產(chǎn)生的Aβ含量不足以發(fā)生聚集[5]；當(dāng)自噬功能出現(xiàn)障礙，可能導(dǎo)致毒性片段產(chǎn)生增多或已形成的Aβ代謝清除異常，Aβ沉積，進(jìn)而造成神經(jīng)元損傷[6-7]。細(xì)胞自噬穩(wěn)態(tài)、Aβ及AD的發(fā)病存在復(fù)雜多向的相互影響，探究其間的關(guān)系與機(jī)制具有重要意義。本研究以SH-SY5Y細(xì)胞為研究對象，旨在探索Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷是否與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬相關(guān)，并基于蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探究。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株由中國人民解放軍總醫(yī)院藥理藥學(xué)研究室培養(yǎng)贈送。

2 藥物和試劑

雷帕霉素(rapamycin,Rapa,M1768)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA， M2296)購自AbMole；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自CORNING；青-鏈霉素(penicillin/streptomycin，P/S)和Aβ25-35購自Sigma；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(FFP24)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒(AR0146)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(0793，噻唑藍(lán)，MTT)、anti-GAPDH(DE0621)和羊抗小鼠IgG-HRP標(biāo)記Ⅱ抗(DE0602)購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；anti-mTOR(#2972)和anti-p-mTOR(#2971)購自Cell Signaling Technology (CST)；anti-akt(ab8805)、anti-p-Akt(ab38449)和anti-LC3B(ab48394)購自Abcam；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(ZB-2301)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3 實驗儀器

酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；恒溫水浴鍋(北京長安科學(xué)儀器廠)；低速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(G.S.)；凝膠成像分析儀(上海天能科技有限公司)。

4 實驗方法

4.1SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞自超低溫冰箱中取出立即投入37 ℃溫水浴中，使凍存液快速融化，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入等量DMEM完全培養(yǎng)液(含10% FBS，1% P/S)，離心，重懸后轉(zhuǎn)移至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞密度達(dá)到約80%以上時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳至2～3代細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)實驗。

4.2實驗分組 Aβ25-35與SH-SY5Y 細(xì)胞共孵育實驗分成6組，分別為空白對照(control)組(不含Aβ25-35)及5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L和25 μmol/L Aβ25-35組。 Aβ25-35加入適量超純水充分溶解，配制至1 000 μmol/L，放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育7～14 d后取出，-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

自噬誘導(dǎo)劑(Rapa)、抑制劑(3-MA)和Aβ25-35聯(lián)用，與SH-SY5Y 細(xì)胞共孵育的實驗共分成6組，分別為空白對照(control)組(不含Aβ25-35，不含自噬抑制劑及誘導(dǎo)劑)、模型(model)組(25 μmol/L Aβ25-35)、Rapa(10 nmol/L)組、3-MA(5 mmol/L)組、Aβ25-35+Rapa組和Aβ25-35+3-MA組。

4.3MTT法檢測細(xì)胞活力 選取傳代后生長狀態(tài)穩(wěn)定的SH-SY5Y細(xì)胞，計數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L，接種至96孔板，每孔100 μL，每組5個復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后按各自分組給藥培養(yǎng)，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，100倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，拍照，加入MTT試劑，4 h后在490 nm波長檢測吸光度(A)值，各組A值與空白對照組相比即為該組細(xì)胞的相對活力。

4.4Western blot法檢測蛋白表達(dá) BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取及測定后，采用蛋白SDS-PAGE分離，濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜， 5% 脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，TBST洗滌膜3次，稀釋Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌膜3次，每次15 min，Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光試劑1：1混勻，室溫條件下避光顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

各項實驗得到的數(shù)據(jù)采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 鏡下觀察不同濃度Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)影響

結(jié)果可見，與正常對照組比較，Aβ25-35與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育24 h后，各組細(xì)胞均有不同程度突觸減少、胞體回圓現(xiàn)象，團(tuán)簇狀聚集細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)，且隨Aβ濃度增大，損傷細(xì)胞與細(xì)胞團(tuán)數(shù)量有增多趨勢，其中25μmol/L Aβ25-35損傷組中畸形和損傷細(xì)胞數(shù)目較多，視野下觀察損傷程度最為嚴(yán)重，見圖1。

Figure 1.The effects of different concentrations of Aβ25-35on the morphological changes of SH-SY5Y cells were observed under optical microscope (×100). A: control group; B: 5 μmol/L Aβ25-35group; C: 10 μmol/L Aβ25-35group; D: 15 μmol/L Aβ25-35group; E: 20 μmol/L Aβ25-35group; F: 25 μmol/L Aβ25-35group.

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察不同濃度Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

2 MTT法檢測不同濃度Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

由表1結(jié)果可以看出，與空白對照組比較，Aβ25-35與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育24 h后，各組細(xì)胞的活力明顯降低(P<0.05)，其中25 μmol/L Aβ25-35損傷組細(xì)胞活力降低最為顯著，損傷最明顯。

3 Western blot法檢測不同濃度Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及Akt/mTOR通路蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比，除5 μmol/L Aβ25-35組外，其余各組細(xì)胞中LC3-II蛋白表達(dá)水平均有顯著提升(P<0.05)；20 μmol/L和25 μmol/L Aβ25-35組LC3-II/LC3-I水平明顯提高(P<0.05)；各濃度組p-Akt/Akt蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；除5 μmol/L Aβ25-35損傷組外，其余各組p-mTOR/mTOR表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),見圖2。

4 鏡下觀察3-MA、Rapa及二者分別與Aβ25-35聯(lián)用對SH-SY5YS細(xì)胞形態(tài)的影響

與空白對照組比較，模型組細(xì)胞密度明顯下降，出現(xiàn)團(tuán)簇狀細(xì)胞聚集；Rapa組細(xì)胞未見明顯細(xì)胞回圓現(xiàn)象，視野下狹長形態(tài)細(xì)胞增多；3-MA組細(xì)胞形態(tài)略有變化，部分細(xì)胞胞壁破損；Rapa+Aβ25-35組細(xì)胞密度明顯降低，突觸減少，回圓細(xì)胞較多，但其回圓細(xì)胞數(shù)目及簇集程度較模型組少；3-MA+Aβ25-35組細(xì)胞密度下降，與模型組相比細(xì)胞密度相接近，破損細(xì)胞較多，見圖3。

5 MTT法檢測3-MA、Rapa及二者分別與Aβ25-35聯(lián)用對SH-SY5YS細(xì)胞活力的影響

與空白對照組比較，模型組、Rapa+Aβ25-35組、3-MA組和3-MA+Aβ25-35組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，Rapa組和3-MA組細(xì)胞活力更高(P<0.05)，聯(lián)合用藥的Rapa+Aβ25-35和3-MA+Aβ25-35組未見顯著性差異；與Rapa組相比，Rapa+Aβ25-35組細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)；與3-MA組相比，3-MA+Aβ25-35組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，見表2。

6 Western blot法檢測3-MA、Rapa及二者分別與Aβ25-35聯(lián)用對SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及Akt/mTOR通路蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比，模型組、Rapa組和Rapa+Aβ25-35組LC3-II蛋白表達(dá)水平及LC3-II/LC3-I水平均有明顯上升(P<0.05)，3-MA組LC3-II表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，Rapa組LC3-II蛋白表達(dá)有上升趨勢但未見統(tǒng)計學(xué)差異，而LC3-II/LC3-I水平明顯增加(P<0.05)，Rapa+Aβ25-35組LC3-II、LC3-II/LC3-I水平均明顯上升(P<0.05)，3-MA組LC3-II、LC3-II/LC3-I水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖4。

與空白對照組比較，各組p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR水平均有不同程度下降(P<0.05)；相比于模型組，Rapa組p-Akt/Akt水平顯著上調(diào)(P<0.05)，3-MA+Aβ25-35組顯著下調(diào)(P<0.05)，3-MA組p-mTOR/mTOR水平顯著上調(diào)(P<0.05)，Rapa+Aβ25-35組顯著下調(diào)(P<0.05)；相比于Rapa組，Rapa+Aβ25-35組的p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR水平均顯著下調(diào)(P<0.05)；相比于3-MA組，3-MA+Aβ25-35組p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.The expression level of autophagy-and Akt/mTOR pathway- related proteins in the SH-SY5Y cells incubated with different concentrations of Aβ25-35. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖2 不同濃度Aβ25-35與SH-SY5Y細(xì)胞孵育后，細(xì)胞內(nèi)自噬和Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

Figure 3.Effects of Rapa, 3-MA and their respective combination with Aβ25-35on the morphological changes of SH-SY5Y cells under optical microscope (×100). A: control group; B: model group; C: Rapa group; D: 3-MA group; E: Rapa+Aβ25-35group; F: 3-MA+Aβ25-35group.

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察Rapa、3-MA及分別聯(lián)用Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

表1 不同濃度Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

Table 1.Effects of different concentrations of Aβ25-35on the viability of SH-SY5Y cells (Mean±SD.n=5)

GroupConcentration (μmol/L)Cell viability (%)Control-100.00±5.74Aβ25-35575.14±3.13?1080.64±3.58?1578.09±7.70?2083.80±4.39?2572.46±8.81?

*P<0.05vscontrol group.

表2 Rapa和3-MA對正常及Aβ25-35損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力影響

Table 2.Effects of Rapa and 3-MA on the viability of normal SH-SY5Y cells and the cells damaged by Aβ25-35(Mean±SD.n=5)

Group Cell viability (%)Control100.00±5.60Model65.96±2.75?Rapa95.75±7.28#Rapa+Aβ25-3567.82±4.46?△▲3-MA80.68±3.21?#△3-MA+Aβ25-3562.42±6.27?△▲

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsRapa group;▲P<0.05vs3-MA group.

Figure 4.The expression of autophagy- and Akt/mTOR pathway-related proteins in SH-SY5Y cells treated with 3-MA, Rapa and their respective combination with Aβ25-35. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsRapa group;▲P<0.05vs3-MA group.

圖4 3-MA、Rapa及二者與Aβ25-35聯(lián)用處理SH-SY5Y細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)自噬和Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

討 論

淀粉樣蛋白假說認(rèn)為，Aβ在腦內(nèi)過量產(chǎn)生或清除出現(xiàn)障礙，其沉積產(chǎn)生毒性，進(jìn)而對神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷破壞，是AD發(fā)病的重要因素之一[8]。有研究表明[9-10]，相較于積聚形成的老年斑(senile plaque，SP)，Aβ的寡聚體可能擁有更強(qiáng)的神經(jīng)毒性，在近年得到越來越多的認(rèn)可與關(guān)注，本研究所選用即為其可人工合成的有效毒性片段Aβ25-35，經(jīng)老化折疊后進(jìn)行細(xì)胞共孵育，結(jié)果顯示，實驗所選取各濃度Aβ25-35均可對正常SH-SY5Y細(xì)胞造成損傷，視野下觀察可見聚集形成簇狀的細(xì)胞團(tuán)，損傷嚴(yán)重組可見細(xì)胞密度明顯下降，MTT結(jié)果中，各損傷組細(xì)胞存活率均顯著性下降，其中25 μmol/L Aβ25-35組的細(xì)胞損傷作用明顯，細(xì)胞存活率最低。

自噬是真核細(xì)胞更新細(xì)胞器、降解代謝蛋白、產(chǎn)生能量和維持系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的重要途徑[11]，主要分為大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autopahgy，CMA)，分類依據(jù)為底物進(jìn)入溶酶體的方式不同；其中，先形成自噬體、底物經(jīng)自噬體包裹轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體的大自噬最為常見。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-I(MAP1LC3-I，LC3-I)和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II(MAP1LC3-II，LC3-II)在細(xì)胞自噬的檢測中最為常用，被稱為自噬標(biāo)志蛋白，是自噬起始過程中的重要指標(biāo)。LC3-I主要存在于胞漿內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞自噬發(fā)生時，LC3-I與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)經(jīng)酯化反應(yīng)結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-II[12]，LC3-II自生成便穩(wěn)定結(jié)合于自噬體內(nèi)、外膜上，其表達(dá)水平與自噬體含量呈正相關(guān)[13]，LC3-II/LC3-I比值即表示LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化程度，多用于判斷細(xì)胞自噬形成所處狀態(tài)。Western blot結(jié)果中，10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L和25 μmol/L Aβ25-35損傷組LC3-II蛋白表達(dá)水平均有明顯增高(P<0.05)，即表明在該組中細(xì)胞內(nèi)自噬體含量增多，其中25 μmol/L Aβ25-35損傷組上調(diào)最為顯著；20 μmol/L和25 μmol/L Aβ25-35損傷組LC3-II/LC3-I水平相對空白對照組明顯上調(diào)(P<0.05)，說明在以上兩組中細(xì)胞自噬呈現(xiàn)誘導(dǎo)狀態(tài)。

mTOR是自噬啟動環(huán)節(jié)的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，對自噬膜的形成十分重要，mTOR活化程度上升，對細(xì)胞自噬起到顯著抑制作用[14]，Rapa是其特異性抑制劑，有研究證明[15]，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞通過自噬途徑實現(xiàn)自我保護(hù)時，Rapa可能通過促進(jìn)自噬增強(qiáng)其保護(hù)作用。Akt在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡調(diào)控等功能中具有重要地位[16],在Akt/mTOR通路中作為mTOR上游靶點(diǎn)，能直接或間接[17]影響mTOR活性。本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35對細(xì)胞內(nèi)Akt和mTOR蛋白磷酸化水平有不同程度下調(diào)，25μmol/L Aβ25-35下調(diào)作用最顯著。

選取損傷作用及對細(xì)胞自噬誘導(dǎo)作用均較強(qiáng)的25 μmol/L Aβ25-35與自噬誘導(dǎo)劑Rapa和自噬抑制劑3-MA聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)一步觀察細(xì)胞自噬狀態(tài)的變化。結(jié)果提示，Aβ25-35與Rapa聯(lián)用后，細(xì)胞自噬水平得到進(jìn)一步促進(jìn)，而對細(xì)胞存活率未見顯著影響；Aβ25-35與3-MA聯(lián)用后，有減弱Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平趨勢，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，細(xì)胞存活率有下降趨勢，但未見顯著差異。由于3-MA自身對正常細(xì)胞也存在一定損傷作用，與Aβ25-35合用后，加重3-MA的損傷。由于Rapa與3-MA對Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響趨勢相反，但二者的加入均未能顯著改善Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用，由此推測細(xì)胞自噬在正常生理狀態(tài)下處在相對穩(wěn)定的狀態(tài)，Aβ25-35對其造成損傷后，細(xì)胞處于應(yīng)激性威脅中，可能引發(fā)代償性的自我保護(hù)作用[18]，誘導(dǎo)自噬以促進(jìn)Aβ25-35的降解代謝。當(dāng)Rapa聯(lián)用后，細(xì)胞自噬雖得到進(jìn)一步促進(jìn)，可能仍不足以清除過量的Aβ25-35，無法改善其損傷或過度促進(jìn)自噬同樣可能破壞自噬平衡，產(chǎn)生損傷。3-MA對于磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3- kinase,PI3K)有特異性抑制作用[19-20]，有研究表明[21]，PI3K活性下調(diào)可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生或促進(jìn)，3-MA本身對于SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用可能與此機(jī)制相關(guān)；3-MA聯(lián)用Aβ25-35后其自噬抑制作用也可能阻礙Aβ25-35的清除，導(dǎo)致細(xì)胞損傷仍較嚴(yán)重。

綜合以上結(jié)果，自噬的穩(wěn)態(tài)在維持細(xì)胞正常生長中具有重要意義，Aβ25-35可能通過下調(diào)Akt/mTOR蛋白的磷酸化水平，對SH-SY5Y細(xì)胞造成損傷并使細(xì)胞自噬呈誘導(dǎo)狀態(tài)。本研究中所選取自噬抑制劑及自噬誘導(dǎo)劑未能明顯減輕Aβ25-35的損傷作用，因此調(diào)整抑制劑和誘導(dǎo)劑濃度并穩(wěn)定自噬平衡可能會有所改善。目前關(guān)于Aβ對細(xì)胞損傷作用的靶點(diǎn)尚不明確，其損傷作用可能通過多種通路或途徑共同調(diào)節(jié)實現(xiàn)，對細(xì)胞自噬途徑進(jìn)一步探究，結(jié)合細(xì)胞凋亡、線粒體等方向進(jìn)行綜合考量，對進(jìn)一步了解其損傷作用機(jī)制具有重要意義。