沈 娟， 高 楓， 郝 琴， 趙 琳,2， 楊彥玲△

(1延安大學醫(yī)學院， 2延安市神經(jīng)科學重點實驗室， 陜西 延安 716000)

氧化應(yīng)激是指在體內(nèi)外有害因素刺激下，體內(nèi)自由基產(chǎn)生增加或機體清除氧自由基能力下降，造成核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物分子的損傷[1]。近年來，氧化應(yīng)激已經(jīng)成為導致腦血管疾病、創(chuàng)傷性疾病、阿爾茨海默癥和帕金森氏癥等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展中的重要病理因素[2-4]。PC12 細胞株來自大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，但因其可分化為具有交感神經(jīng)元特性的細胞，常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)研究[5-6]；乙酰左旋肉堿(acetyl-L-carnitine，ALC)為左旋肉堿的酯化物，是一種強抗氧化劑，具有抗氧化、抗凋亡和抗炎癥等廣泛的藥理作用而備受學者們關(guān)注[7-8]，且極易通過血腦屏障到達中樞神經(jīng)[9]，具有明顯的神經(jīng)保護作用[10]，且ALC在提高男性生育能力方面的應(yīng)用已得到公認。

本研究通過H2O2建立PC12細胞氧化損傷模型，采用ALC預(yù)處理PC12細胞，觀察其對氧化損傷模型細胞活力及凋亡的影響，探討ALC對PC12細胞氧化損傷的作用。同時，通過檢測cleaved caspase-3和核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)的蛋白水平以及對Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響，探討該藥物對PC12細胞氧化損傷的可能機制，為臨床應(yīng)用ALC治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供理論和實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12細胞株購自中科院上海細胞庫。乙酰左旋肉堿和0.25% 胰酶購自Sigma；30%的H2O2購自天津化學試劑有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；CCK8購自索萊寶公司；細胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒和細胞核蛋白/胞漿蛋白提取試劑盒購自上海生工；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自Thermo；抗Nrf2、cleaved caspase-3、GAPDH和Lamin B1抗體購自CST。酶標儀購自TECAN；凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad。

2 方法

2.1細胞的培養(yǎng) PC12細胞培養(yǎng)于含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁生長鋪滿整個瓶底時，加入0.25% 胰酶消化、傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，傳代嚴格控制在3～4代以內(nèi)，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞用于后續(xù)實驗。

2.2CCK8法檢測不同濃度H2O2作用下的細胞活力 收集對數(shù)期的PC12細胞，將1×109/L的細胞懸液種于96孔板上，待細胞生長至對數(shù)期，加入不同濃度(50、100、200、300、400和500 μmol/L)的H2O2分別作用細胞2 h、4 h和6 h，每組設(shè)置3個孔，以未加H2O2的孔作為對照，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中作用不同時間(2 h、4 h和6 h)；用1×PBS清洗2遍，加入100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基和10 μL CCK8檢測液，37 ℃孵育4 h，酶標儀檢測每孔在波長450 nm處的吸光度，最后進行分析計算。以半數(shù)抑制濃度[11](細胞活力下降50%左右)作為模型制備的最佳損傷條件[12]，造成細胞中度氧化損傷模型[13]。

2.3ALC對細胞活力的影響 收集對數(shù)生長期的PC12細胞，將1×109/L的細胞懸液種于96孔板上，待細胞生長至對數(shù)期，加入不同濃度(50、100、200、300、400和500 μmol/L)的ALC培養(yǎng)24 h，用CCK8法檢測細胞活力，方法同2.2。篩選出ALC藥物的安全濃度。根據(jù)上述結(jié)果，選擇3個不同濃度作為ALC低、中、高濃度組進行后續(xù)實驗。

2.4ALC對H2O2刺激的細胞活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)水平的影響 取對數(shù)生長期的 PC12細胞，藥物組加入ALC預(yù)處理24 h后，吸棄原液，藥物組和模型組中均加入H2O2作用2 h，用無血清培養(yǎng)基沖洗細胞1次，加入熒光探針 DCFH-DA 10 μmol/L，37 ℃孵育1 h。流式細胞儀上機檢測細胞熒光，重復(fù)3次。

2.5ALC對H2O2刺激的細胞凋亡的影響 根據(jù)CCK8結(jié)果選取ALC濃度為100、200和400 μmol/L分別作為低、中、高濃度組。取對數(shù)生長期的 PC12細胞，藥物組加入不同濃度ALC預(yù)處理24 h后，和模型組中均加入H2O2，作用同樣時間，正常對照組不加H2O2，棄掉培養(yǎng)液，加入10 μL annexin V-FITC和5 μL PI，4 ℃染色30 min，流式細胞術(shù)分析細胞的凋亡率。

2.6ALC對細胞凋亡蛋白以及Nrf2信號通路蛋白水平的影響 按照前面的培養(yǎng)條件，藥物預(yù)處理后再加入H2O2作用一定時間，收集各組細胞，洗滌、離心后，加入含PMSF的細胞裂解液，冰上裂解30 min，離心吸取上清液為提取的總蛋白，細胞核蛋白/胞漿蛋白提取按照試劑盒說明書進行，BCA法檢測蛋白濃度后稀釋至一定濃度，-20 ℃保存。洗凈、晾干玻璃板，灌入15%的分離膠至預(yù)定高度，并加入雙蒸水液封，室溫下靜置1 h 。配制5%濃縮膠，棄去雙蒸水，加入濃縮膠，插入梳子，室溫靜置30 min。將配置好的凝膠板置于電泳槽中，加入電泳液；將蛋白樣品與6×樣品緩沖液混合，100 ℃煮沸5 min，每孔加入15 μL 樣品，進行電泳；濃縮膠電壓調(diào)至80 V，分離膠電壓為120 V，電泳至溴酚藍到達凝膠底部。采用轉(zhuǎn)膜電流300 mA，電流轉(zhuǎn)膜60～90 min，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜。加入5% 脫脂奶粉封閉2 h ；加入 I 抗稀釋液，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min；加入 II 抗稀釋液，37 ℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min；曝光、顯影、顯色，凝膠成像系統(tǒng)測定其灰度值，分析目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH的灰度值比值，實驗重復(fù)3次，取平均值。

2.7免疫熒光染色觀察ALC對Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響 細胞培養(yǎng)于含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，待細胞長到匯合度為80%時，胰酶進行消化，血清終止消化后，培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為每孔1×104個細胞，接種于24孔板中(含細胞培養(yǎng)爬片)，每孔加入1 mL培養(yǎng)基。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。ALC預(yù)處理24 h后，再加入H2O2氧化應(yīng)激造模2 h，棄掉培養(yǎng)上清；小心取出細胞爬片置于載玻片上，1×PBS輕柔清洗2次，用4%多聚甲醛500 μL(以蓋住爬片為宜)，室溫下固定45 min；PBS洗3次，每次5 min；加入0.3%Triton X-100的10% normal goat serum-PBS溶液500 μL室溫下封閉1 h；封閉液按1 ∶200稀釋Nrf2抗體；滴加到細胞爬片上，陰性對照組用PBS代替 I 抗，濕盒內(nèi)4 ℃過夜，室溫復(fù)溫45 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加對應(yīng) II 抗，室溫避光孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加少量DAPI染色液，室溫放置5 min，吸去染液，PBS洗3次，每次5 min；滴加抗熒光猝滅封片，注意避免產(chǎn)生氣泡。熒光顯微鏡下觀察，隨機取3個視野，分析蛋白表達情況及核轉(zhuǎn)移水平。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計處理。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組內(nèi)多個樣本均數(shù)之間兩兩比較用Tukey法(Tukey multiple comparison test)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 不同濃度H2O2對PC12細胞活力的影響

CCK8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，50～500 μmol/L的H2O2作用不同時間(2 h、4 h和6 h)均顯著降低PC12細胞活力(P<0.01)，見圖1。以半數(shù)抑制濃度為選取標準，200 μmo/L的H2O2刺激2 h和50 μmol/L的 H2O2刺激4 h符合條件。后續(xù)實驗中我們選取200 μmol/L的H2O2作用2 h為建立氧化損傷模型的條件。

Figure 1.The effect of H2O2at different concentrations on the viability of PC12 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vseach H2O2group with different time.

圖1 不同濃度H2O2對PC12細胞活力的影響

2 ALC對H2O2刺激的PC12細胞活力的影響

同樣，CCK8法檢測細胞活力的結(jié)果顯示，ALC的處理濃度在100～500 μmol/L時不會顯著降低細胞活力，而50 μmol/L濃度預(yù)處理24 h時，則顯著引起細胞活力降低(P<0.05)，見圖2A。這說明ALC的安全濃度為100～500 μmol/L，因此我們?nèi)?00、200和400 μmol/L濃度作為低、中、高濃度組進行后續(xù)實驗。同樣，CCK8檢測結(jié)果顯示，ALC(100、200和400 μmol/L)藥物預(yù)處理均能明顯提高H2O2介導的PC12細胞活力(P<0.01)，見圖2B。

3 ALC對H2O2刺激的PC12細胞形態(tài)的影響

在倒置顯微鏡下，對照組細胞大小均一，細胞形態(tài)呈多邊形，細胞飽滿，輪廓清晰，邊緣有小突起，折光性強，細胞貼壁緊密。模型組中正常細胞數(shù)量明顯減少，細胞大小不一，并且呈梭形、類圓形，細胞腫脹，細胞邊緣毛糙，細胞皺縮，貼壁松弛，折光率較差,部分細胞因壞死或凋亡而脫壁。但在ALC預(yù)處理組中，低濃度組較模型組，細胞形態(tài)明顯改善，部分細胞出現(xiàn)多邊形，折光率增加；在中、高濃度ALC組，正常細胞數(shù)量增多，尤其在中濃度200 μmol/L組中，正常細胞數(shù)量明顯增加，細胞形態(tài)和折光率與對照組無明顯差異，細胞飽滿，大多數(shù)細胞仍保持多邊小突起形態(tài)，見圖3A。對各組受損細胞進行計算分析，與H2O2組相比，ALC藥物預(yù)處理后，受損細胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)，說明ALC能夠減少H2O2誘導的 PC12 細胞損害，見圖3B。

Figure 2.The effect of ALC on the viability of PC12 cells. A: PC12 cells were treated with different concentrations of ALC for 12 h and 24 h; B: PC12 cells were pre-incubated with different concentrations of ALC for 24 h and then cotreated with H2O2. Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsH2O2group.

圖2 ALC對H2O2介導的PC12細胞活力的影響

Figure 3.Microscopic observation of cell morphology (×200) and the count of damaged cells in different groups. Mean±SD.n=5.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsH2O2group.

圖3 顯微鏡觀察細胞形態(tài)和各組受損細胞數(shù)量的比較

4 ALC對細胞內(nèi)活性氧生成的影響

流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，經(jīng)過不同濃度的ALC預(yù)處理后，細胞內(nèi)ROS的水平逐漸降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明ALC能夠清除H2O2誘導的 PC12 細胞內(nèi)異常增多的ROS，見圖4。

Figure 4.The effect of ALC on H2O2-mediated ROS levels in the PC12 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsH2O2group.

圖4 ALC對H2O2介導的PC12細胞ROS水平的影響

5 ALC對細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與模型組相比，不同濃度的ALC均可減輕H2O2誘導的PC12細胞凋亡(P<0.01)，見圖5。

Figure 5.The effect of ALC on the apoptosis of PC12 cells stimulated with H2O2. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsH2O2group.

圖5 ALC對H2O2介導的PC12細胞凋亡的影響

6 ALC對抗氧化蛋白與凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

Western blot條帶灰度分析結(jié)果顯示，ALC均可顯著調(diào)節(jié)Nrf2和cleaved caspase-3的表達量。與模型組比較，ALC(100、200和400 μmol/L)預(yù)處理組胞漿內(nèi)Nrf2表達呈下降趨勢(P<0.01)，核內(nèi)Nrf2表達呈上升趨勢(P<0.01)；與模型組比較，ALC(100、200和400 μmol/L)預(yù)處理組總cleaved caspase-3的蛋白水平下降(P<0.01)，見圖6。

Figure 6.Western blot analysis was used to determine the effect of ALC on the protein levels of Nrf2 and cleaved caspase-3. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsH2O2group.

圖6 Western blot法檢測ALC對Nrf2和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

7 ALC對Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響

免疫熒光染色觀察結(jié)果顯示，正常組Nrf2主要在胞漿內(nèi)表達，模型組與ALC藥物處理組胞漿和胞核內(nèi)均有表達，且ALC組胞核內(nèi)表達陽性細胞數(shù)增多，見圖7A。核內(nèi)Nrf2表達陽性細胞計數(shù)分析結(jié)果顯示，與模型組比較，ALC組核內(nèi)Nrf2陽性細胞明顯增多，其中200 μmo/L組的差異最為顯著(P<0.01)，見圖7B。

討 論

近年來認識到氧化應(yīng)激涉及循環(huán)、疾病、呼吸、消化、泌尿及生殖等多個系統(tǒng)多種疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。因此，減緩或抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)已成為疾病發(fā)生機理研究中需要解決的重要問題。本實驗研究結(jié)果顯示，ALC對H2O2誘導的PC12細胞具有顯著抑制凋亡，提高細胞活力的作用。Western blot實驗結(jié)果提示，ALC可明顯下調(diào)激活型caspase-3(cleaved caspase-3)蛋白的水平，而上調(diào)Nrf2蛋白的水平。因此，ALC對氧化損傷的細胞模型具有一定的保護作用。

Nrf2是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子。在生理狀態(tài)下，Nrf2主要存在于細胞質(zhì)中，與肌動蛋白結(jié)合蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)結(jié)合，處于相對抑制狀態(tài)。生理條件下Keap1經(jīng)泛素連接酶Gul 3，以泛素化底物結(jié)合蛋白的形式與Nrf2在胞漿結(jié)合，因此，Keap1主導Nrf2泛素化降解，維持Nrf2于正常水平，從而抑制下游基因的表達。Nrf2- Keap1/ARE通路是近年來研究最多的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[15]，在抗氧化損害方面扮演著重要的角色[16]。Keap1是Nrf2-Keap1/ARE信號通路的主調(diào)節(jié)器，可根據(jù)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)打開或關(guān)閉Nrf2-Keap1/ARE[17]。在氧化應(yīng)激、炎性損傷等病理狀態(tài)下，Keap1的構(gòu)象通過絲裂原活化蛋白激酶、磷脂肌醇激酶和磷脂肌醇信號等途徑發(fā)生變化，Nrf2與Keap1發(fā)生解離并轉(zhuǎn)移進細胞核內(nèi)，與Maf結(jié)合形成異二聚體，識別ARE上的結(jié)合位點并與之結(jié)合，啟動下游靶基因抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因等的轉(zhuǎn)錄，提高細胞抵抗外源性損傷的能力。研究表明，隨著年齡增長腦中Nrf2表達下降, 導致氧化應(yīng)激反應(yīng)失衡[18]。因此，Nrf2信號通路可能是治療神經(jīng)退行性疾病潛在的研究方向。在AD患者腦中Nrf2 主要定位在海馬神經(jīng)元的細胞質(zhì)中，細胞核 Nrf2 表達水平較正常對照組明顯下降[19]。在本實驗中，免疫熒光染色結(jié)果顯示，ALC預(yù)處理組核內(nèi)Nrf2表達陽性的細胞數(shù)明顯多于模型組，也進一步驗證了Western blot的結(jié)果。以上結(jié)果說明，ALC能促進胞漿內(nèi)Nrf2向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。大量的實驗研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2能對抗細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[20-22]。也有學者在體研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2通路對脊髓損傷具有神經(jīng)保護作用[23-24]。除此，更多研究提示Nrf2與炎癥[25-26]、凋亡[27-28]和自噬[29-30]也存在復(fù)雜關(guān)系。因此，如何有效地激活Nrf2-keap1/ARE通路已經(jīng)越來越受到研究者的重視。本研究結(jié)果揭示，乙酰左旋肉堿通過激活Nrf2通路抑制氧化應(yīng)激引起的細胞凋亡，提高細胞存活率。

Figure 7.Immunofluorescence staining was used to observe the effect of ALC on Nrf2 nuclear translocation. A: the expression position of Nrf2 (the scale bar=50 μm); B: the quantitative analysis of nucleus Nrf2 positive cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsH2O2group.

圖7 免疫熒光染色觀察ALC對Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響