侯紹蔚， 張連清， 席海英， 趙愛玲， 侯 恒

(1山西大同大學醫(yī)學院, 2大同市第五人民醫(yī)院皮膚科, 3大同市第五人民醫(yī)院神經內科， 山西 大同 037009)

黑色素瘤是一種惡性程度很高的腫瘤，是最致命的皮膚癌，其2年生成率為15%，5年生成率僅為5%。病理研究表明，黑色素瘤內有很多免疫細胞，可以據此開發(fā)針對免疫系統(tǒng)的治療藥物。近年來，利用人體自身免疫系統(tǒng)靶向治療的方法已初見成效[1-3]。研究表明，機體內各種腫瘤都存在對應的原癌基因和抑癌基因，原癌基因被激活、抑癌基因被抑制與腫瘤的發(fā)生有直接關系[4]。研究表明，微小RNA-128-3p(microRNA-128-3p,miR-128-3p)可以通過靶向抑癌基因抑制T淋巴細胞白血病、肝癌細胞和神經膠質瘤的增殖，其低表達可能提示患者的不良預后[5-8]。Wnt信號通路通常與機體器官發(fā)生相關，轉錄因子4(transcription factor 4，TCF4)是其重要調節(jié)蛋白，高表達TCF4可異常激活該通路使β-catenin轉移到細胞核內，競爭性結合TCF4，形成β-catenin/TCF4復合物，與此同時聚集且激活TCF4下游的轉錄因子，最終導致細胞異常增殖和腫瘤發(fā)生[9-12]。本文以人黑色素瘤A375細胞為研究對象，探究高表達miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞增殖、侵襲和上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的調控作用及其作用機制。

材 料 和 方 法

1 試劑與儀器

DMEM細胞培養(yǎng)液、0.25%胰酶和胎牛血清均購自Gibco；miR-128 mimic和pcDNA-TCF4(pc-TCF4)由上海吉瑪生物設計合成；Lipfectamine 2000轉染試劑盒、TRIzol試劑盒、反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自Thermo Fisher；I抗和II抗均購自Abcam；RIPA裂解液購自Sigma；BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司；Dual-Luciferase? Report報告基因試劑盒購自Promega；EdU試劑盒購自廣州銳博生物有限公司；Matrigel購自Invitriogen。

PCR儀、電泳儀及半干轉膜儀均購自美國伯樂公司；Gel View 6000化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自廣州云星儀器有限公司。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 人惡性黑色素瘤A375細胞株購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心。用含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據細胞生長情況，融合率達到85%以上進行傳代培養(yǎng)。

2.2細胞轉染 將細胞傳代培養(yǎng)于12孔板中，用培養(yǎng)液將細胞密度調整為1×109/L，每孔接種1 mL細胞懸液。將培養(yǎng)板置于上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h后，根據轉染試劑盒說明書采用Lipofectamine 2000將miR-128 mimic和/或pc-TCF4轉染到A375細胞，轉染4 h后更換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后進行相關檢測。

2.3RT-qPCR 將細胞隨機分為對照(control)組和miR-128 mimic組。control組加入正常細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，miR-128 mimic組加入含有miR-128 mimic的轉染液進行培養(yǎng)。48 h后用Trizol試劑提取細胞RNA，用反轉錄試劑盒合成miR-128-3p的cDNA，進行PCR擴增后，根據熒光定量PCR試劑盒對cDNA進行檢測，以GAPDH為內參照。實驗所用引物由上海生工設計合成。miR-128-3p 上游引物序列為5’-UCACAGUGAACCGGUCUCUUU-3’，下游引物序列為5’-AGAGACCGGUUCACUGUGAUU-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’，下游引物序列為5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’。

2.4螢光素酶報告基因實驗 首先，通過生物信息預測TCF4在miR-128-3p上的結合位點，并對結合位點片段進行擴增。隨后將擴增片段插入pcDNA載體上，構建TCF4野生型質粒。利用基因位點突變技術將結合位點片段中部分核苷酸突變，構建TCF4突變型質粒。用TCF4野生型質?；騎CF4突變型質粒和miR-128 mimic對A375細胞進行共轉染，根據Dual-Luciferase? Report報告基因試劑盒說明書檢測各組螢光素酶活性。

2.5EdU染色檢測細胞增殖 取第3代A375細胞，接種于96孔板內，每孔接種2×107/L細胞懸液200 μL，細胞貼壁后，換終濃度為10 μmol/L的EdU培養(yǎng)液，孵育48 h，每組設3個重復孔。棄去培養(yǎng)液，PBS清洗，多聚甲醛固定30 min，按照說明書加入Apollo染色反應液30 min后，再加入Hoechst染色反應液30 min，最后用PBS清洗1遍。每組每個孔隨機取3個視野在熒光顯微鏡下觀察計數并拍照。EdU陽性細胞在綠光激發(fā)下發(fā)紅色熒光，Hoechst陽性細胞在紫外光激發(fā)下發(fā)藍色熒光。EdU陽性細胞標記率(%)=發(fā)紅色熒光細胞數/發(fā)藍色熒光細胞數×100%。

2.6細胞侵襲實驗 將轉染后細胞傳代接種于提前用Matrigel包被的Transwell小室上層，細胞密度為4×108/L，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，Transwell小室下層則加入正常細胞培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)48 h后用無菌棉簽拭去小室上層細胞，用結晶紫將遷移至小室下層的A375細胞染色，每組隨機選取5個視野對染色細胞進行基數統(tǒng)計。實驗至少重復3次，每組6個復孔。

2.7Western blot實驗 將細胞隨機分為control組、miR-128 mimic組、pc-TCF4組和miR-128 mimic+pc-TCF4(mimic+pc-TCF4)組，用miR-128 mimic和/或pc-TCF4轉染A375細胞后，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測各組蛋白濃度并調平。每組取等量蛋白質用12% SDS-PAGE分離蛋白后，轉移蛋白質到PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白質2 h，以1 ∶1 000的濃度加入抗TCF4、E-cadherin、vimentin、cyclin D和c-Myc的I抗，4 ℃孵育過夜。第2天棄去I抗，用緩沖液清洗PVDF膜后，加入II抗，室溫封閉1 h后，滴加ECL于暗室曝光顯影。以GAPDH為內參照。

3 統(tǒng)計學處理

用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對所有實驗數據進行統(tǒng)計分析，組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行檢驗。實驗結果以均數±標準差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-128-3p與TCF4的靶向關系

生物信息預測結果顯示，miR-128-3p序列上存在連續(xù)的TCF4結合位點，見圖1A。同時，采用螢光素酶報告實驗進一步確定了miR-128-3p和TCF4的靶向關系。實驗結果顯示miR-128-3p能顯著降低TCF4野生型質粒的螢光素酶活性(P<0.01)，當TCF4上結合位點突變后，miR-128-3p對TCF4質粒螢光素酶活性的抑制作用消失，見圖1D。

Figure 1.Targeting relationship between miR-128-3p and TCF4. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group;△△P<0.01vspc-TCF4 wt group.

圖1 miR-128-3p與TCF4的靶向關系

2 過表達miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞表達TCF4的影響

RT-qPCR和Western blot實驗結果表明，miR-128 mimic組miR-128-3p的表達水平較control組顯著升高(P<0.01)，見圖1B，說明過表達成功。與control組比較，miR-128 mimic組的TCF4相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，pc-TCF4組的TCF4相對蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；同時，miR-128 mimic+pc-TCF4組與pc-TCF4組相比較，TCF4的相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01),見圖1C，提示過表達miR-128-3p可以靶向抑制黑色素瘤A375細胞TCF4的蛋白表達。

3 過表達miR-128-3p抑制黑色素瘤A375細胞增殖

EdU標記的A375細胞孵育48 h后，鏡下觀察EdU陽性細胞數量。結果顯示，與control組比較，miR-128 mimic組的陽性細胞標記率顯著降低(P<0.01)，而pc-TCF4組的陽性細胞標記率顯著升高(P<0.01)，同時，mimic+pc-TCF4組的陽性細胞標記率較pc-TCF4組顯著降低(P<0.01)，見圖2。這提示miR-128-3p可以通過靶向調節(jié)TCF4的表達抑制黑色素瘤A375細胞的增殖。

Figure 2.The effect of miR-128-3p on the proliferation of melanoma A375 cells (Apollo and Hoechst staining, ×400). Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

圖2 miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞增殖的影響

4 過表達miR-128-3p抑制黑色素瘤A375細胞的侵襲能力

采用侵襲實驗檢測過表達miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞侵襲能力的影響，結果表明與control組比較，miR-128 mimic組的侵襲細胞數顯著減少(P<0.01)，而pc-TCF4組侵襲細胞數顯著增加(P<0.01)；同時，mimic+pc-TCF4組與pc-TCF4組比較，侵襲細胞數顯著減少(P<0.01)，見圖3。這表明miR-128-3p可通過抑制TCF4的表達降低黑色素瘤A375細胞的侵襲能力。

Figure 3.The effect of miR-128-3p on the invasion ability of melanoma A375 cells (crystal violet staining, ×400). Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

圖3 miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞侵襲能力的影響

5 過表達miR-128-3p抑制黑色素瘤A375細胞EMT的發(fā)生

將各組細胞置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)可見，與control組比較，miR-128 mimic組細胞形態(tài)多呈卵圓形或方形，排列緊密；pc-TCF4組細胞形態(tài)多呈長梭形，排列疏松；而mimic+pc-TCF4組較pc-TCF4組相比，細胞形態(tài)多呈梭形，但細胞排列更為緊密，見圖4A。

Western blot檢測轉染miR-128-3p后對黑色素瘤A375細胞EMT標志物表達的影響，結果顯示與control組比較，miR-128 mimic組的E-cadherin表達水平顯著升高，vimentin表達水平顯著降低(P<0.01)。而與control組比較，pc-TCF4組E-cadherin表達水平顯著降低，vimentin表達水平顯著升高(P<0.01)。與pc-TCF4組相比，mimic+pc-TCF4組E-cadherin表達水平顯著升高，vimentin蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，見圖4B。

綜上所述，miR-128-3p可通過抑制間充質標志蛋白vimentin、增加上皮標志蛋白E-cadherin的表達而抑制A375細胞的EMT能力。

Figure 4.The effect of miR-128-3p on EMT of melanoma A375 cells. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

圖4 miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞EMT的影響

6 過表達miR-128-3p抑制黑色素瘤A375細胞TCF4下游靶基因的蛋白表達

Western blot檢測轉染miR-128-3p后對黑色素瘤A375細胞TCF4下游分子cyclin D和c-Myc表達的影響，結果顯示,與control組比較，miR-128-mimic組cyclin D和c-Myc的蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01)，而pc-TCF4組兩者的表達水平均顯著升高(P<0.01)；同時，mimic+pc-TCF4組兩者的表達水平較pc-TCF4組顯著降低(P<0.01)，見圖5。這提示過表達miR-128-3p可以顯著抑制TCF4下游分子cyclin D和c-Myc的表達水平。

Figure 5.The effects of miR-128-3p on the protein expression of cyclin D and c-Myc in the melanoma A375 cells. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

圖5 miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞cyclin D和c-Myc蛋白表達的影響

討 論

研究表明，人體有超過60%的蛋白質編碼基因上都具有miRNAs的結合位點，在細胞生長、增殖、凋亡和遷移過程中具有重要的調控作用，同時可以通過調控蛋白編碼基因的表達影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展[13-14]。但是miR-128-3p與TCF4的靶向關系還未得到證實。本實驗研究表明，miR-128-3p可以靶向結合TCF4而抑制其表達，而pc-TCF4能明顯減弱miR-128-3p對TCF4表達的抑制作用。

影響腫瘤細胞增殖是miRNAs抑制腫瘤/癌癥發(fā)生發(fā)展的重要機制。大量研究表明，miR-199a/b-3p在多種癌癥中表現出抑癌基因和抑制細胞增殖的作用，包括肝癌、甲狀腺乳頭狀癌、子宮內膜樣腺癌、腎細胞癌、骨肉瘤、卵巢癌和胃癌[4]。雙螢光素酶報告分析證實miR-330-3p靶向TPX2,負向調節(jié)TPX2的表達，從而抑制黑色素瘤細胞的增殖[15]。miR-128-3p也可以通過靶向抑癌基因抑制T淋巴細胞白血病、肝癌細胞和神經膠質瘤的增殖[5-8]。靶向調控TCF4可以抑制人成纖維細胞的增殖[16]。為了探討miR-128-3p能否通過靶向TCF4調控黑色素瘤A375細胞的增殖能力，本實驗發(fā)現，TCF4能促進A375細胞增殖，但miR-128-3p能通過靶向抑制TCF4的表達而降低黑色素瘤A375細胞的增殖。

另外，研究表明，可通過調控miR-128-3p的表達抑制基底細胞樣乳腺癌細胞遷移[17]，同時miR-128-3p的過表達也可以靶向調節(jié)DJ-1基因的表達而促進肝癌細胞的凋亡，從而對抗癌藥索拉菲尼產生較好的反應[18]，且miR-128-3p可以抑制高度惡性非小細胞肺癌的轉移和耐藥性[19]。但miR-128-3p對黑色素瘤細胞遷移能力的影響還未見報道。本文研究發(fā)現，黑色素瘤A375細胞過表達miR-128-3p后侵襲細胞數量明顯減少，說明miR-128-3p能抑制黑色素瘤A375細胞的侵襲，同時，過表達TCF4后，侵襲細胞數量明顯增加。說明，TCF4能增強A375細胞的侵襲能力，但miR-128-3p能通過靶向抑制TCF4的表達而抑制A375細胞的侵襲能力。

EMT是指上皮細胞失去極性和細胞獲得間充質特性從而增加細胞轉移和侵襲能力的過程[20-21]，是多種腫瘤發(fā)生轉移和侵襲的重要過程。E-cadherin被認為是此過程的基礎，E-cadherin參與并介導細胞之間相互黏附，是一種重要的細胞黏附因子，與多種腫瘤的侵襲和轉移有不可分割的聯系，它的低表達或者表達缺失被認為是腫瘤EMT的關鍵步驟[22]。研究發(fā)現[23]，犬腎臟上皮細胞過度表達TCF4能增加細胞侵襲能力，從而加速腫瘤EMT的發(fā)生，其中可見上皮標志蛋白E-cadherin的明顯下調和間充質標志蛋白vimentin的表達上升。miR-128-3p能作為腫瘤抑制因子通過靶向ZEB1抑制食管鱗狀細胞癌的轉移和EMT[24]。另有報道稱，通過下調Wnt/β-catenin信號通路，miR-128-3p可以抑制非小細胞肺癌EMT[19]。為了證明miR-128-3p能否靶向TCF4抑制黑色素瘤細胞的EMT，我們通過實驗發(fā)現：在倒置顯微鏡下，過表達miR-128-3p的細胞形態(tài)呈卵圓形或方形并且排列緊密；同時可高表達上皮標志蛋白E-cadherin,低表達間充質標志蛋白vimentin，而TCF4可以減弱miR-128-3p對E-cadherin和vimentin的調節(jié)作用。這說明在A375細胞中miR-128-3p可抑制A375細胞之間極性喪失，阻止其向間充質細胞發(fā)展，降低細胞的侵襲和轉移能力，抑制A375細胞EMT的發(fā)生。

當Wnt信號通路激活時，β-catenin轉移到核內競爭性結合TCF4形成β-catenin/TCF4復合物，激活TCF4下游的轉錄因子，如cyclin D和c-Myc，最終導致細胞異常增殖和腫瘤發(fā)生[10]。研究表明，Wnt信號的突變異常激活TCF4靶基因可以促進結直腸癌的惡性轉化[25]。本實驗過表達miR-128-3p后發(fā)現黑色素瘤A375細胞內cyclin D和c-Myc蛋白表達水平均有明顯下調，但同時表達TCF4后，兩者的表達水平明顯上調。這說明miR-128-3p能靶向抑制TCF4對cyclin D和c-Myc蛋白表達水平的上調作用。

綜上所述，本文初步探討了miR-128-3p在黑色素瘤A375細胞增殖、侵襲和EMT中的作用，說明miR-128-3p可以通過靶向抑制TCF4表達而實現對A375細胞增殖、侵襲和EMT的抑制作用，為進一步研究miR-128-3p在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供了新的思路。