程 慧，黃 徽，周陶鴻，彭青枝

(湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，武漢 430070)

食用油中苯并(a)芘(BaP)的檢測方法目前主要是GB 5009.27—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯并(a)芘的測定》中規(guī)定的液相色譜分析法。該方法檢測糧油和肉類食品中苯并(a)芘的含量適用于非現(xiàn)場檢測，不適用于現(xiàn)場的快速檢測[1-2]。食品快速檢驗(yàn)方法可以在第一時間篩出有害物質(zhì)且滿足市場監(jiān)管的需求，其中較常用的方法有酶聯(lián)免疫法、膠體金試紙法、免疫層析法[3]。這3種方法應(yīng)用于食品中風(fēng)險物質(zhì)的定量檢測難點(diǎn)基本上集中于抗體及人工抗原的獲得，人工抗原合成的關(guān)鍵在于載體蛋白是否與其偶聯(lián)，可通過酶聯(lián)免疫試劑盒檢測人工抗原的蛋白質(zhì)含量，選擇最佳的人工抗原及其誘導(dǎo)機(jī)體免疫產(chǎn)生的抗體組合建立免疫傳感器[4-10]。免疫傳感器結(jié)合比色法是一種可以應(yīng)用于市場監(jiān)管中食品化學(xué)性污染物檢測的重要手段，其成功解決了如何將免疫識別轉(zhuǎn)化為快速且裸眼可見的難題，在食品中重金屬及農(nóng)藥殘留等化學(xué)污染物殘留的快速檢測領(lǐng)域具有儀器價格低廉、檢測速度較快等優(yōu)點(diǎn)。

傳統(tǒng)的免疫比色反應(yīng)一般是基于酶標(biāo)記物催化底物實(shí)現(xiàn)顯色反應(yīng)，單純的酶標(biāo)記抗體信號放大作用比較局限。一般的信號放大措施僅實(shí)施在標(biāo)記抗體表面，而本試驗(yàn)通過磁珠標(biāo)記識別抗原磁珠標(biāo)記的抗原與苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液競爭抗體后，再與酶標(biāo)記抗體結(jié)合后進(jìn)行顯色反應(yīng)，苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度越低，磁珠標(biāo)記抗原結(jié)合的酶標(biāo)記物顯色越深，最后加入終止液洗脫后檢測體系的吸光度可以間接反映苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度。免疫磁珠的制備過程及其免疫分析原理見圖1。

圖1 免疫磁珠的制備過程及其免疫分析原理示意圖

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用小鼠由武漢華美生物工程有限公司提供，食用油樣品均為市場抽檢樣品。苯并(a)芘、苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲標(biāo)準(zhǔn)品，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；苯并(a)芘單克隆抗體、苯并(a)芘羊抗鼠二抗、苯并(a)芘包被抗原，武漢華美生物工程有限公司；羧基化磁珠(MB，粒徑1.0～2.0 μm，10 mg/mL)，購自美國Charm生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、4-嗎啡啉乙磺酸(MES)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、脲酶(Canavalia ensiformis，Type III)，購自美國Sigma-Aldrich公司；正己烷、二甲基亞砜、氫氧化鈉，購自國藥集團(tuán)有限公司。

JN100-4恒溫混勻儀，UV-1901紫外-可見分光光度計(jì)，Waters e2695Alliance高效液相色譜儀，AB SCIEX 4500液相串聯(lián)質(zhì)譜。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苯并(a)芘人工抗原及抗體的制備及篩選

根據(jù)文獻(xiàn)[3]提供的方法合成苯并(a)芘的人工抗原及單克隆抗體，將合成的H-BaP-BSA、H-BaP-KLH及H-BaP-OVA 3種免疫原免疫小鼠，免疫5次后選取效價及抑制率較高的試驗(yàn)小鼠進(jìn)行劑量加大的免疫試驗(yàn)，提取小鼠的抗血清，純化后獲得相應(yīng)單克隆抗體，利用間接競爭酶聯(lián)免疫法篩選出有效包被抗原和抗體的組合，通過單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對已經(jīng)篩選出的抗體進(jìn)行性能測試。同時，選取與苯并(a)芘分子結(jié)構(gòu)類似的苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲同樣進(jìn)行間接競爭酶聯(lián)免疫法，進(jìn)一步測試該單克隆抗體的交叉反應(yīng)率。

1.2.2 快速檢測苯并(a)芘顯色反應(yīng)的構(gòu)建

取4 μL(25 mg/mL)MB依照文獻(xiàn)[10-12]方法在其表面共價結(jié)合苯并(a)芘包被抗原(4 μg)及抗體(4 μg)，并將其重新分散在400 μL 50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖溶液中，4℃保存待用。將40 μL已處理的免疫磁珠分散液與100 μL不同質(zhì)量濃度的苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品提取液在離心管中混合均勻，加入70 μL 50 mmol/L苯并(a)芘單克隆抗體，37℃渦旋混勻反應(yīng)30 min，再加入酶標(biāo)苯并(a)芘二抗[10]100 μL，37℃渦旋混勻反應(yīng)30 min，所得混合液經(jīng)磁分離后，采用100 μL pH 7.0 50 mmol/L PBST(吐溫體積分?jǐn)?shù)為0.2%)和100 μL 50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl交替洗3次。最后向其中依次滴加100 μL 0.1 mol/L HCl和100 μL 50 mmol/L四甲基聯(lián)苯。充分混勻，靜置2 min后，將上清液于550 nm測定吸光度。

1.2.3 食用油樣品前處理

稱取10 g油樣于離心管中，加入5 mL 正己烷和15 mL二甲基亞砜并混合均勻。旋渦振蕩2 min，然后4 000 r/min離心2 min。棄去上層正己烷層。加入5 mL 正己烷，旋渦振蕩30 s，然后4 000 r/min離心30 s。棄去上層正己烷層。加入10 mL 氫氧化鈉溶液(2 mol/L)和15 mL正己烷，旋渦振蕩30 s，然后4 000 r/min離心30 s。吸取上層正己烷層于15 mL離心管，4 000 r/min離心2 min。取正己烷層于氮吹管中，50℃氮吹或空氣吹10 min，然后加入200 μL二甲基亞砜復(fù)溶，混合均勻，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的設(shè)計(jì)及分析

苯并(a)芘的分子結(jié)構(gòu)中不含氨基、羧基、羥基等可與載體蛋白直接偶聯(lián)的基團(tuán)，通過有機(jī)反應(yīng)引入與載體蛋白結(jié)合的基團(tuán)是目前合成人工抗原常用的方法，所得產(chǎn)物需核磁共振圖譜驗(yàn)證，過程煩瑣。因?yàn)槿斯た乖哪康氖谴碳に拗鳟a(chǎn)生相應(yīng)抗體，其結(jié)合蛋白質(zhì)的含量可間接驗(yàn)證活潑基團(tuán)的引入，由于在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時將Cu2+還原成Cu+，而二喹啉甲酸試劑可特異地與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，形成有顏色的復(fù)合物，該復(fù)合物在562 nm處有高吸光度，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸光度計(jì)算蛋白質(zhì)的含量[7-8]。圖2為1.0 mg/L苯并(a)芘人工抗原和10 μg/L苯并(a)芘的紫外吸收光譜圖。

圖2 1.0 mg/L苯并(a)芘人工抗原(a)和10 μg/L苯并(a)芘(b)的紫外吸收光譜圖

由圖2可以看出，苯并(a)芘人工抗原相較于苯并(a)芘在550 nm處有明顯的特征吸收峰，表明苯并(a)芘人工抗原成功合成。

2.2 單克隆抗體的特異性

將H-BaP-BSA、H-BaP-KLH及H-BaP-OVA 3種人工抗原分別對小鼠進(jìn)行免疫試驗(yàn)，2個月后提取小鼠血清，利用間接酶聯(lián)免疫法測定抗血清的效價，結(jié)果見表1。

表1 人工抗原和抗體的間接酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果

由表1可知，小鼠對3種人工抗原均產(chǎn)生了免疫反應(yīng)，測得的血清效價符合常規(guī)要求，其中血清效價及抑制率最高的是H-BaP-OVA，故選擇該人工抗原作為試驗(yàn)抗原及抗體的制備來源。

以H-BaP-OVA為包被抗原，采用該人工抗原刺激小鼠產(chǎn)生的抗體建立酶聯(lián)免疫檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。

由圖3可以看出，當(dāng)苯并(a)芘的質(zhì)量濃度為0.05～10.00 mg/L時，抑制率與苯并(a)芘質(zhì)量濃度的對數(shù)成良好的線性關(guān)系，R2=0.995 6。

通過間接競爭酶聯(lián)免疫對抗體的靈敏度及特異性進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

由表2可知，H-BaP-OVA作為人工抗原篩選出的抗體可靈敏識別苯并(a)芘，其靈敏度為5.37 μg/L，抗體對苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲的交叉反應(yīng)率很低，證明該抗體特異性較好。

圖3 苯并芘的酶聯(lián)免疫法檢測曲線

化合物半數(shù)抑制質(zhì)量濃度/(μg/L)交叉反應(yīng)率/%苯并(a)芘>5.37>100苯并蒽>1.23>1.19苯并熒蒽>1 000<0.01苯并苝>1 000<0.01菲>1 000<0.01

2.3 條件優(yōu)化

為了確?；诿庖叽胖榈姆磻?yīng)有最佳的酶催化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在其他試驗(yàn)條件一致的情況下(1.2.2試驗(yàn)方法)，分別考察了抗體和辣根過氧化酶的用量，結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 抗體用量對吸光度的影響

圖5 辣根過氧化酶用量對吸光度的影響

從圖4可以看出，在抗體用量低于4 μg時，100 ng/mL苯并(a)芘的信號響應(yīng)隨著抗體用量的增加而不斷增大，直到抗體用量達(dá)到4 μg開始平緩。這說明抗體用量低于4 μg時，不能足夠識別抗原及酶標(biāo)二抗，但是過多的抗體也會影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

從圖5可以看出，在高鹽溶液中100 μg辣根過氧化酶使納米探針的分散性更好，且產(chǎn)生較強(qiáng)的信號響應(yīng)。因此，選擇4 μg苯并(a)芘抗體和100 μg辣根過氧化酶作為合成納米探針的最佳條件。

溫育時間是影響免疫分析性能的另一個重要因素。試驗(yàn)研究了不同溫育時間下100 ng/mL BaP在免疫磁珠上的信號響應(yīng)情況，結(jié)果見圖6。

圖6 溫育時間對吸光度的影響

從圖6可以看出，隨著免疫反應(yīng)溫育時間的延長，響應(yīng)信號不斷增大，直到溫育時間達(dá)到60 min后響應(yīng)達(dá)到一個平臺。這說明該免疫磁珠溫育60 min時免疫反應(yīng)可以達(dá)到飽和狀態(tài)，因此選擇60 min作為免疫反應(yīng)分析的最佳溫育時間。

2.4 方法的線性回歸方程和檢測限

在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，配制0.5 pg/mL～500 ng/mL 的苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用1.2.2方法測定吸光度。結(jié)果表明，吸光度與苯并(a)芘質(zhì)量濃度的對數(shù)呈較好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：A=1.819 3-0.432 3lgC，相關(guān)系數(shù)為0.992，檢測限為0.12 ng/mL，定量限為0.5 μg/kg，比文獻(xiàn)[1,9,13]低得多。

2.5 方法的特異性

分別考察了2、5、10 ng/mL的苯并(a)芘、苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲標(biāo)準(zhǔn)品在該免疫磁珠上的信號響應(yīng)，用免疫磁珠檢測，每個樣品重復(fù)3次，判斷免疫磁珠的特異性。結(jié)果見表3。

表3 苯并(a)芘、苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲標(biāo)準(zhǔn)品分別在免疫磁珠上的響應(yīng)情況

從表3可以看出，與苯并(a)芘在該免疫磁珠上的靈敏信號響應(yīng)相比，苯并蒽、苯并熒蒽、苯并苝、菲在該免疫磁珠上沒有引起明顯的信號響應(yīng)，說明非特異性多環(huán)芳烴在該免疫磁珠上引起的交叉反應(yīng)較小。

2.6 方法的穩(wěn)定性

在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，用同批次和不同批次的免疫磁珠分別檢測1、10、100 ng/mL苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品，每個樣品重復(fù)測定5次，結(jié)果如表4所示。

表4 方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，該免疫磁珠具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，RSD為3.4%～5.3%。

2.7 方法的加標(biāo)回收率

在食用油樣品中添加一定量的苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品，使苯并(a)芘質(zhì)量濃度為0.5、2、5、10 μg/kg，樣品經(jīng)1.2.3、1.2.2方法處理。所選食用油樣品經(jīng)液相色譜法確定為未檢出苯并(a)芘。經(jīng)提取回收，將液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用、電化學(xué)傳感器法所得分析結(jié)果與免疫磁珠分析結(jié)果相比較(液相色譜條件為C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)、流動相為乙腈-水(88∶12)、流速1.0 mL/min、熒光檢測器激發(fā)波長384 nm、發(fā)射波長406 nm、柱溫35℃、進(jìn)樣量20 μL)。液質(zhì)聯(lián)用條件參考文獻(xiàn)[13]。電化學(xué)傳感器法參考文獻(xiàn)[14])。結(jié)果見表5。

表5 不同方法的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，本方法平均加標(biāo)回收率為89.3%～100.1%，本方法的測定結(jié)果與其他3種方法測定結(jié)果相近，表明本方法用于實(shí)際樣品分析苯并(a)芘含量具有良好的可靠性和準(zhǔn)確度。

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用間接免疫法結(jié)合顯色反應(yīng)快速檢測食用油中苯并(a)芘。通過在磁珠結(jié)合苯并(a)芘抗原，進(jìn)一步連接抗體及酶標(biāo)二抗，因辣根過氧化酶與四甲基聯(lián)苯發(fā)生的經(jīng)典顯色反應(yīng)，從而間接檢測苯并(a)芘含量。此方法的檢出限為0.12 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，加標(biāo)回收率為89.3%～100.1%，方法具有良好的特異性和穩(wěn)定性，可實(shí)現(xiàn)食用油中苯并(a)芘的快速檢測。