于林楠 張奎全 祁 嘯 高 爽 任立新

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院綜合一科, 錦州121000)

肺癌是人類發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤，其對(duì)人類的生命健康造成巨大威脅[1]。近30年來(lái)很多國(guó)家報(bào)道肺癌的發(fā)病率、死亡率均呈明顯的上升趨勢(shì)，其中男性肺癌發(fā)病率和死亡率居所有惡性腫瘤之首[2,3]。臨床上首選治療方案以外科手術(shù)為主，放療、化療為輔，但其預(yù)后不甚理想，存在很多并發(fā)癥，如食管癌、脊髓炎等[4]。因此，尋找高效的精準(zhǔn)靶向治療意義重大。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一類約18～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA，其在腫瘤中作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用[5]。敲減抑癌miRNA會(huì)上調(diào)其靶向的癌基因，而致癌miRNA的過(guò)度表達(dá)能下調(diào)其靶向的腫瘤抑制基因，這為腫瘤治療開辟了新方向[6,7]。miR-144-3p在多種癌癥中均為抑癌基因，包括肺癌、肺腺癌、肺鱗癌等[8-10]。但miR-144-3p在肺癌中的作用機(jī)制尚未完全研究清楚。人表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)為酪氨酸激酶家族成員之一，其由跨膜區(qū)域、胞外受體結(jié)合區(qū)域、胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域組成[11]。EGFR是晚期肺癌中最常見的癌癥驅(qū)動(dòng)因子。自噬(Autophagy)發(fā)生在動(dòng)物細(xì)胞中，能夠吞噬自身細(xì)胞器并使其與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，以降解內(nèi)容物，完成細(xì)胞本身的代謝和細(xì)胞器的更新，其既可保護(hù)正常細(xì)胞的DNA受損、蛋白質(zhì)堆積，又可使癌細(xì)胞免受或耐受抗癌治療。盡管如此，自噬調(diào)節(jié)藥物也已開始在臨床上應(yīng)用[12,13]。本研究將檢測(cè)肺癌細(xì)胞中miR-144-3p、EGFR的表達(dá)，觀察過(guò)表達(dá)miR-144-3p、敲減EGFR、過(guò)表達(dá)EGFR對(duì)肺癌細(xì)胞遷移、侵襲、自噬的影響，揭示miR-144-3p可抑制肺癌細(xì)胞遷移、侵襲，促進(jìn)自噬，其機(jī)制可能與靶向EGFR有關(guān)，將為肺癌的靶向預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B、人肺腺癌細(xì)胞A549購(gòu)自ATCC；BCA蛋白定量試劑盒、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；PVDF膜購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司；Transwell小室、基質(zhì)膠、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；流式細(xì)胞儀(FALS CALIBAR)購(gòu)于美國(guó)BD公司；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)ABI公司；pc DNA3.1購(gòu)自上海酶研生物；RNA抽提試劑盒購(gòu)自南京萊富賽生物公司；miR-144-3p mimics(UCAUGUAGUAGAU-AUGACAU)、 miR-control (UUCUCGAACGUGUCAC-GUUUU)、sicontrol(UUCUCCGAACGUGUCACGU)、 siEGFR(UGUCUGGAAACAGUCCUGCUCCUCA)均購(gòu)自上海吉瑪公司；鼠抗人EGFR多克隆抗體購(gòu)自上海盟研公司；兔抗人LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1多克隆抗體購(gòu)自碧云天；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG抗體購(gòu)自深圳豪地華拓公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B、人肺腺癌細(xì)胞A549均用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將miR-144-3p組(轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimics)、miR-NC組(miR-control)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-control)siEGFR組(轉(zhuǎn)染siEGFR)、miR-144-3p+pcDNA 3.1組(miR-144-3p mimics和pcDNA 3.1共轉(zhuǎn)染)、miR-144-3p+EGFR組(miR-144-3p mimics和pcDNA 3.1-EGFR共轉(zhuǎn)染)，轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染成功后，進(jìn)行qRT-PCR、Western blot、Transwell、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)并分析結(jié)果。

1.2.3qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 取適量1.2.2中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，用Trizol液裂解細(xì)胞后，按照RNA抽提試劑盒說(shuō)明書操作提取RNA，進(jìn)行定量，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書操作合成cDNA。再按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行EGFR和miR-144-3p的檢測(cè)。用2-ΔΔCt計(jì)算EGFR和miR-144-3p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1.2.2中各組細(xì)胞，RIPA裂解后，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量后變性，然后進(jìn)行SDS蛋白電泳，之后進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2 h,然后用一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜后用標(biāo)記過(guò)的二抗37℃孵育2 h。最后加入顯影混合液，進(jìn)行曝光。以目的條帶灰度值與GADPH灰度值的比值表示目的蛋白EGFR相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲 取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1.2.2中各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至105個(gè)/ml。取100 μl加入上室，再取600 μl含血清的培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)過(guò)夜。取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，PBS洗滌3次，固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色約20 min，PBS洗滌3次。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細(xì)胞，隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。

細(xì)胞侵襲檢測(cè)需在小室上表面涂抹適量厚度的基質(zhì)膠，其余按照遷移檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟操作。最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細(xì)胞，隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1.2.2中各組細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒技術(shù)手冊(cè)要求操作。psiCHECK2載體以螢火蟲熒光素酶活性為內(nèi)參，檢測(cè)psiCHECK2-EGFR-3′UTR WT和psiCHECK2-EGFR-3′UTR MUT的表達(dá)，觀察miR-144-3p與EGFR的結(jié)合能力。

2 結(jié)果

2.1miR-144-3p和EGFR在肺癌細(xì)胞中的表達(dá) 運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)BEAS-2B、A549細(xì)胞中miR-144-3p和EGFR mRNA的表達(dá)，與BEAS-2B細(xì)胞相比，A549細(xì)胞中miR-144-3p表達(dá)顯著降低，EGFR表達(dá)顯著升高(圖1A)；用Western blot檢測(cè)BEAS-2B、A549細(xì)胞中EGFR的蛋白表達(dá)，與BEAS-2B細(xì)胞相比，A549細(xì)胞中EGFR的蛋白表達(dá)量顯著升高(圖1B、C)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2過(guò)表達(dá)miR-144-3p對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲及自噬的影響 將miR-144-3p mimics、miR-NC轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，標(biāo)記為miR-144-3p組、miR-NC組。與miR-NC組相比，miR-144-3p組細(xì)胞中miR-144-3p的表達(dá)顯著升高(圖2A)，細(xì)胞遷移和侵襲量均顯著降低(圖2B)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的蛋白表達(dá)量均顯著升高(圖2C、D)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3敲減EGFR對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲及自噬的影響 將si-EGFR、si-NC轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，標(biāo)記為si-EGFR組、si-NC組。與si-NC組相比，si-EGFR組

圖1 miR-144-3p和EGFR在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-144-3p and EGFR in lung cancer cellsNote: A.mRNA expression of miR-144-3p and EGFR in BEAS-2B and A549 cells;B and C.Protein expression of EGFR in BEAS-2B and A549 cells;*.P<0.05 vs BEAS-2B group.

圖2 過(guò)表達(dá)miR-144-3p對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲及自噬的影響Fig.2 Effect of overexpression of miR-144-3p on migration,invasion and autophagy of A549 cellsNote: A.miR-144-3p mimics on the expression of miR-144-3p in A549 cells;B.miR-144-3p on the effect of migration and invasion of A549 cells;C and D.miR-144-3p on the effect of the proteins expression of autophagy-related proteins in A549 cells;*.P<0.05 vs miR-NC group.

細(xì)胞中EGFR的表達(dá)顯著升高(圖3A)，細(xì)胞遷移和侵襲量均顯著降低(圖3B)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的蛋白表達(dá)量均顯著升高(圖3C、D)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4miR-144-3p的靶基因EGFR 通過(guò)TargetScan對(duì)miR-144-3p和EGFR的結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-144-3p與EGFR存在結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞熒光活性，與miR-NC組相比，miR-144-3p組WT-EGFR細(xì)胞的熒光活性顯著降低，MUT-EGFR細(xì)胞的熒光活性差異不明顯(圖4)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？梢?，EGFR是miR-144-3p的靶基因。

2.5過(guò)表達(dá)EGFR逆轉(zhuǎn)了miR-144-3p對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲及自噬的抑制作用 與miR-NC組相比，miR-144-3p組細(xì)胞中EGFR mRNA表達(dá)顯著降低(圖5A)，細(xì)胞遷移、侵襲量均顯著降低(圖5B)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的蛋白表達(dá)量均顯著升高(圖5C、D)；與miR-144-3p+pcDNA 3.1組相比，miR-144-3p+pcDNA 3.1-EGFR組細(xì)胞中EGFR mRNA表達(dá)顯著升高(圖5A)，細(xì)胞遷移、侵襲量均顯著升高(圖5B)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的蛋白表達(dá)量均顯著降低(圖5C、D),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？梢姡^(guò)表達(dá)EGFR逆轉(zhuǎn)了miR-144-3p對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲及自噬的抑制作用。

圖3 敲減EGFR對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲及自噬的影響Fig.3 Effect of knockdown of EGFR on migration,invasion and autophagy of A549 cellsNote: A.EGFR on the expression of EGFR in A549 cells;B.EGFR on the migration and invasion of A549 cells;C and D.EGFR on the protein expression of autophagy-related proteins in A549 cells;*.P<0.05 vs si-NC group.

圖4 EGFR與miR-144-3p的結(jié)合作用Fig.4 Binding function between EGFR and miR-144-3pNote: A.The 3′UTR of miR-144-3p contains a nucleotide sequence complementary to EGFR;B.The effect of miR-144-3p on the fluorescence activity of A549 cells;*.P<0.05 vs miR-NC group.

圖5 過(guò)表達(dá)EGFR逆轉(zhuǎn)miR-144-3p對(duì)A549細(xì)胞遷移侵襲及自噬的抑制作用Fig.5 Overexpression of EGFR reverses inhibitory effect of miR-144-3p on migration,invasion and autoph-agy of A549 cellsNote: A.The effect of different treatment groups on the mRNA expression of EGFR in A549 cells;B.The effect of different treatment groups on migration and invasion of A549 cells;C and D.The effect of different treatment groups on the protein expression of autophagy-related proteins in A549 cells.Compared with miR-NC group,*.P<0.05;compared with miR-144-3p+pcDNA3.1 group,#.P<0.05.

3 討論

EGFR在機(jī)體的各種上皮腫瘤中過(guò)度表達(dá)、擴(kuò)增或突變，并與腫瘤的侵襲性和治療抗性密切相關(guān)。自噬激活參與腫瘤細(xì)胞的生存調(diào)控[14]。Jutten等[15]運(yùn)用qPCR、免疫組織化學(xué)、克隆生存、增殖測(cè)量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EGFR與自噬的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，高EGFR表達(dá)細(xì)胞對(duì)自噬抑制劑氯喹更敏感，且高EGFR表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)出較低的自噬通量，揭示EGFR高表達(dá)細(xì)胞和腫瘤的存活高度依賴于自噬。Wei等[16]在非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，EGFR可與自噬蛋白Beclin1結(jié)合，導(dǎo)致其多位點(diǎn)酪氨酸磷酸化，增強(qiáng)與抑制劑的結(jié)合力，并降低Beclin1相關(guān)的VPS34激酶活性，EGFR酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)可逆轉(zhuǎn)EGFR突變，將Beclin1與其抑制劑結(jié)合以恢復(fù)非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)細(xì)胞的自噬，進(jìn)一步在NSCLC腫瘤異種移植中發(fā)現(xiàn)，酪氨酸磷酸化Beclin1突變體的表達(dá)導(dǎo)致自噬減少、腫瘤生長(zhǎng)增強(qiáng)、腫瘤去分化和對(duì)TKI治療的抵抗。因此，致癌受體酪氨酸激酶可直接調(diào)節(jié)核心自噬機(jī)制，這可能有助于腫瘤進(jìn)展和化學(xué)抗性。潘云虎[17]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在肺腺癌組織中高表達(dá)且于miR-646的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其與miR-646在肺腺癌細(xì)胞中為靶向關(guān)系，過(guò)表達(dá)miR-646可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。馬陽(yáng)等[18]在肺腺癌的研究中闡明，EGFR在肺腺癌中高表達(dá)，且沉默EGFR可增強(qiáng)A549細(xì)胞的自噬能力，深入研究發(fā)現(xiàn)，非突變EGFR的自噬活性顯著高于突變EGFR，揭示肺腺癌細(xì)胞的自噬活性除了與EGFR表達(dá)量相關(guān)外，還與EGFR突變狀態(tài)有關(guān)。本研究運(yùn)用qRT-PCR、Western blot檢測(cè)了肺癌細(xì)胞中EGFR的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，EGFR在肺癌中高表達(dá)，這與前人的研究結(jié)果相吻合；進(jìn)一步用Transwell檢測(cè)了沉默EGFR的A549細(xì)胞的遷移和侵襲，沉默EGFR可抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且可促進(jìn)細(xì)胞自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的表達(dá)，提示沉默EGFR可抑制肺癌遷移和侵襲，促進(jìn)自噬。

miRNAs 為18～22 nt的非編碼小RNA，通過(guò)與靶基因mRNA發(fā)生特異性結(jié)合而影響其轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮基因調(diào)控功能[19]。miRNAs 可調(diào)控大約 50%以上的哺乳動(dòng)物基因蛋白編碼[20]。大量研究表明miRNAs 參與多種生物調(diào)控，其在惡性腫瘤進(jìn)展中的作用尤為突出。微陣列數(shù)據(jù)Meta分析顯示，miRNAs中的miR-144在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌中均為低表達(dá)[21]。李偉等[22]報(bào)道，miR-144在肺鱗癌中低表達(dá)，且miR-144的表達(dá)量與患者生存率呈正相關(guān)，進(jìn)一步在DAVID網(wǎng)站預(yù)測(cè)其信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，miR-144可通過(guò)72個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)參與Ras、Wnt、Hippo等信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存，進(jìn)而影響患者的存活時(shí)間。陳閃閃[23]在肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-144在肺癌組織中低表達(dá)，且其與患者腫瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，過(guò)表達(dá)miR-144可抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬，并可抑制裸鼠的成瘤，其機(jī)制與miR-144靶向負(fù)調(diào)控TIGAR有關(guān)。本研究檢測(cè)了miR-144-3p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p低表達(dá)，這與前人的研究結(jié)果相一致；進(jìn)一步通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-144-3p的肺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-144-3p可抑制肺癌細(xì)胞遷移侵襲，促進(jìn)自噬；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，EGFR為miR-144-3p的靶基因，且過(guò)表達(dá)EGFR可逆轉(zhuǎn)miR-144-3p對(duì)肺癌細(xì)胞遷移、侵襲及自噬的作用。

綜上所述，miR-144-3p可抑制肺癌細(xì)胞遷移侵襲并促進(jìn)自噬，其機(jī)制可能與靶向EGFR有關(guān)，為肺癌的靶向治療提供新靶點(diǎn)。