劉 慧，張彬彬，王昊楠，曹 斐，吳曉霞，單永鋒，郁 皓

(無錫市第五人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇 無錫 214000)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位居前列[1-2]。全球每年新發(fā)胃癌約100萬例，我國占42%～48%[3-5]。目前，手術(shù)治療是可能治愈胃癌的主要手段，然而大部分胃癌患者確診時已為進(jìn)展期[6]。進(jìn)展期胃癌發(fā)展迅速、預(yù)后極差，治療選擇非常有限，傳統(tǒng)化療初治有效[7]，但治療時間窗有限，大部分患者在治療過程中很快相繼發(fā)生耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，中位生存期一般不超過12個月[8-10]。

治療后耐藥、復(fù)發(fā)及侵襲轉(zhuǎn)移等是惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因。隨著靶向治療的迅速發(fā)展，腫瘤的精準(zhǔn)治療技術(shù)不斷提高，合理個體化方案的制定是未來腫瘤治療的主要發(fā)展方向。近年來，惡性腫瘤的靶向治療以及傳統(tǒng)化療藥物基礎(chǔ)上的聯(lián)合靶向治療逐漸成為研究熱點(diǎn)。針對不同患者群體設(shè)計個體化治療方案以及實現(xiàn)進(jìn)展期胃癌的精準(zhǔn)治療是提高患者生存質(zhì)量、延長生存期的關(guān)鍵。隨著胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中分子生物學(xué)和分子病理學(xué)等機(jī)制的深入研究，有關(guān)安全、有效、新型靶向藥物的研發(fā)逐漸增多，胃癌分子靶向治療的應(yīng)用前景廣闊。目前，胃癌的靶向治療策略主要包括抗人表皮生長因子受體2治療[11]、抗雷帕霉素靶蛋白治療[12]、抗程序化細(xì)胞死亡受體-1[13]、表皮生長因子受體抑制劑和血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑[14]等。近年來，注射用曲妥珠單抗(赫賽汀)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、曲妥珠單抗美坦新衍生物、阿帕替尼、依維莫司等藥物相繼應(yīng)用于臨床，但大部分進(jìn)展期胃癌患者的中位生存期仍未超過16個月[15]。因此，仍需進(jìn)一步探索新的進(jìn)展期胃癌治療手段。

核糖體蛋白L34(ribosomal proteins L34，RPL34)屬于RPL34E家族，具有合成蛋白質(zhì)的功能。早期研究發(fā)現(xiàn)，RPL34在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在某些惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、生長、侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，RPL34在胃癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)，但RPL34在胃癌組織中的表達(dá)和分子作用機(jī)制及其對胃癌的影響尚不明確[18]。本研究主要探討RPL34基因在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年2月至2019年2月在無錫市第五人民醫(yī)院治療的60例胃癌患者的胃癌組織標(biāo)本、配對癌旁組織(距腫瘤邊緣≥3 cm)及正常胃黏膜組織，將術(shù)后離體標(biāo)本分為兩份，一份于液氮速凍，并轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱凍存；另一份于中性甲醛固定后制成石蠟標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實。60例胃癌患者中，男39例，女21例，年齡29～81歲，中位年齡55歲；其中高分化型胃癌10例，中分化型胃癌23例，低分化型胃癌27例； 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N05例，N115例，N222例，N318例；TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期21例，Ⅲ期31例。所選患者術(shù)前均未行放療、化療及免疫治療。

1.2試劑來源 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、MGC80-3、BGC-823和MKN-45均購自中科院上海細(xì)胞研究所，RPMI1640培養(yǎng)基和胰酶蛋白(美國Gibco公司，批號：A11-102)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連Takara公司，批號：M1705)、提取總RNA所用的Trizol、TaqDNA聚合酶、引物設(shè)計合成(美國Invitrogen公司，批號：15596-026)。RPL34基因兔抗人多克隆抗體(購自美國Cell Signaling Technology 公司，批號：A0209)，免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，Western blot試劑盒購自上海吉凱基因公司(英國Amersham公司，批號：A0217)，雙抗(一抗鼠抗，二抗羊抗鼠)購自上海新先鋒藥業(yè)有限公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌SGC-7901、MGC80-3、BGC-823和MKN-45細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，加入含有乙二胺四乙酸的胰酶溶液，按1∶3傳代，在5%二氧化碳的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4實時聚合酶鏈反應(yīng)法檢測不同胃癌細(xì)胞株中RPL34基因mRNA的表達(dá) 根據(jù)美國Invitrogen公司的Trizol操作抽提各組細(xì)胞株的總mRNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作獲取互補(bǔ)DNA，將得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，設(shè)定程序為兩步法：經(jīng)95 ℃ 15 s預(yù)變性后，再行95 ℃ 5 s變性以及60 ℃ 30 s的延火退伸，共循環(huán)45次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，以循環(huán)閾值(cycle thre-shold，Ct)值反映基因含量，通過2-ΔΔCt方法計算不同組胃癌細(xì)胞株中RPL34基因的表達(dá)情況。

1.5免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定 胃癌組織、配對癌旁組織和正常胃黏膜組織蠟塊切片(4 μm)常規(guī)脫蠟水化，采用鏈菌霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶染色法，嚴(yán)格按照試劑盒說明步驟操作，將一抗原液按1∶100稀釋，抗體設(shè)陽性和陰性對照，光鏡下觀察免疫組織化學(xué)染色切片的顯色反應(yīng)，計數(shù)500個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞未著色記0分、淺黃色記1分、棕黃色記2分、棕褐色記3分；陽性細(xì)胞面積<5%記0分、6%～25%記1分、26%～50%記2分、51%～75%記4分、>76%記4分；根據(jù)以上兩項分值的乘積得出該切片的最終得分，0～3分為陰性(-)，>3分為陽性(+)。

1.6Western blot法檢測RPL34基因表達(dá)水平 采用Western blot法檢測胃癌組織和正常胃黏膜組織中RPL34蛋白的表達(dá)情況。參照試劑盒說明書進(jìn)行總蛋白抽提和蛋白濃度測定，從不同樣品中取出等量蛋白，分別將樣品蛋白濃度調(diào)為2 g/L，將蛋白上樣加入相等體積緩沖液中混勻，沸水煮浴5 min，隨后制膠進(jìn)行電泳，電泳分離后轉(zhuǎn)膜，在4 ℃、300 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，然后進(jìn)行免疫顯色，用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液室溫下封閉2 h，分別加入稀釋的一抗RPL34(1∶1 000)和GAPDH(1∶3 000)孵育2 h，TBST緩沖液洗膜3次，用封閉液稀釋相應(yīng)的二抗，在室溫下進(jìn)行二抗羊抗鼠IgG孵育聚偏氟乙烯膜2 h，采用試劑盒進(jìn)行顯色，在暗房中獲得顯示條帶的膠片。

2 結(jié) 果

2.1不同胃癌細(xì)胞株中RPL34 mRNA的表達(dá)水平 通過2-ΔΔCt計算方法得出SGC-7901、MGC80-3、BGC-823和MKN-45細(xì)胞株中RPL34蛋白的相對表達(dá)水平分別為1.000±0.033、1.332±0.112、0.662±0.042和1.308±0.062，不同胃癌細(xì)胞株中RPL34 mRNA的相對表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=61.477，P<0.001)，其中MGC80-3胃癌細(xì)胞株中RPL34 mRNA的表達(dá)最高。

2.2RPL34基因在胃癌組織中的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)分析顯示，RPL34在胃癌組織、配對癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)率分別為81.7%(49/60)、38.3%(23/60)和10.0%(6/60)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=63.665，P<0.001)。

2.3胃癌組織和正常胃黏膜組織中RPL34蛋白的表達(dá)情況 正常胃黏膜組織與胃癌組織中RPL34蛋白的表達(dá)存在差異，見圖1。胃癌組織中RPL34蛋白的表達(dá)水平為0.634±0.003，正常胃黏膜組織為0.166±0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=44.083，P<0.001)。

RPL34：核糖體蛋白L34；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.4RPL34基因表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡、腫塊大小的RPL34基因陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，不同腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的RPL34基因陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，病理分化程度越差、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且TNM分期越晚的胃癌患者RPL34基因陽性表達(dá)率越高，見表1。

表1 RPL34表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 (例)

RPL34：核糖體蛋白L34

3 討 論

核糖體舊稱“核糖核蛋白體”或“核蛋白體”，被認(rèn)為是細(xì)胞的細(xì)胞器之一，除哺乳動物的成熟紅細(xì)胞以及植物篩管細(xì)胞外，普遍存在于其他細(xì)胞中。一般原核細(xì)胞只有一種核糖體，而真核細(xì)胞有兩種核糖體。核糖體是一種細(xì)胞內(nèi)的核糖核蛋白顆粒，是蛋白質(zhì)合成的重要細(xì)胞器，在快速增殖、分泌旺盛的細(xì)胞中較多，其成分由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，主要功能是將mRNA上的核苷酸順序按指令翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸順序，故被稱為肽鏈的裝配機(jī)，即細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分子機(jī)器。核糖體蛋白是構(gòu)成核糖體的蛋白質(zhì)，在真核生物細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)80種核糖體蛋白，廣泛分布于各組織[19-20]。研究表明，核糖體蛋白不僅具有合成蛋白質(zhì)的功能[21]，還可能參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、DNA修復(fù)、細(xì)胞增殖，并可維持細(xì)胞形態(tài)等核糖體以外的功能[22-23]。近年來，在胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等消化道腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)RPL34基因表達(dá)，其對腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲以及血管生成起促進(jìn)作用，可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。對腫瘤組織核糖體蛋白的深入研究，進(jìn)一步闡明了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。

目前，國內(nèi)外對RPL34基因與胃癌生物學(xué)特點(diǎn)及其臨床預(yù)后關(guān)系的研究較少，本研究通過實時聚合酶鏈反應(yīng)法測定不同胃癌細(xì)胞株中RPL34基因表達(dá)情況的研究顯示，RPL34在不同胃癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，在MGC80-3細(xì)胞株中呈高表達(dá)。體外實驗證實，RPL34在胃癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)[16]。采用免疫組織化學(xué)法檢測胃癌組織、配對癌旁組織和正常胃黏膜組織中RPL34基因的表達(dá)顯示，胃癌組織中RPL34基因的表達(dá)明顯高于正常胃黏膜組織。采用Western blot法進(jìn)行檢測進(jìn)一步驗證了上述結(jié)果，提示胃癌組織中RPL34蛋白表達(dá)高于正常胃黏膜組織。本研究結(jié)果顯示，不同腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的RPL34基因陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示RPL34蛋白高表達(dá)可能是影響胃癌患者預(yù)后的危險因素，可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程。

綜上所述，胃癌組織中RPL34基因的高表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。RPL34 mRNA的表達(dá)水平可能成為胃癌患者隨訪及預(yù)后評估的重要指標(biāo)，并可能為制定精準(zhǔn)胃癌靶向治療策略提供新的線索。核糖體蛋白具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多、功能多樣等特點(diǎn)，目前對RPL34基因及其與腫瘤生物學(xué)特性關(guān)系的研究較少，未來對RPL34基因的深入研究將為認(rèn)識腫瘤的臨床病例特征以及腫瘤治療提供幫助。