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        尪痹片對骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化過程中的成骨標(biāo)志物的影響研究

        2019-11-19 05:06:08劉益臻李立章王炎付坤飛
        醫(yī)藥前沿 2019年29期
        關(guān)鍵詞:磷酸酶成骨甲氨蝶呤

        劉益臻 李立章 王炎 付坤飛

        (貴州中醫(yī)藥大學(xué) 貴州 貴陽 550001)

        尪痹片由著名國醫(yī)大師焦樹德教授創(chuàng)立,是國家六類新藥痹病系列藥之一,為中華中醫(yī)藥學(xué)會風(fēng)濕病分會協(xié)定處方,臨床用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)療效顯著,病理研究和臨床研究均表明該藥可減輕骨破壞程度,促進骨形成[1,2],骨形成的重要細胞為成骨細胞,骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)可分化為成骨細胞[3],因此本研究使用尪痹片含藥血清體外干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細胞,探討其對成骨分化的保護作用。

        1.資料與方法

        1.1 藥物與試劑

        尪痹片,仙靈骨葆膠囊,甲氨蝶呤片,SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞株(中國科學(xué)院),成骨分化培養(yǎng)基,茜素紅,腫瘤壞死因子α,TNF-α,一步法快速WB(HRP)試劑盒,高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒,蛋白膜印跡再生液,TRNzol總RNA提取試劑,PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser,SYBR?Premix Ex Taq ? Ⅱ,ROX plus,DL2,000 DNA Marker,康為世紀(jì)SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(CW0022),堿性磷酸酶(AKP)測試盒。

        1.2 實驗儀器

        No:164-5050電 泳 儀,Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System蛋白電泳槽,Mini Trans-Blot,蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng),TY-80脫色搖床。ZS-2板式酶標(biāo)儀,202-2AB電熱恒溫箱,ABI7500熒光定量PCR儀,SK-D1807-E Analog 3D Shaker,RS-25S超聲波細胞粉碎機,LIDE 200掃描儀,ST60-4微孔板恒溫振蕩器,AUW-220D電子分析d平。

        1.3 含藥血清的制備

        清潔級SD大鼠雄性60只(中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,許可證號:SCXK2012-0011),隨機分成6組,每組10只,分別為空白組、尪痹片高劑量組、尪痹片中劑量組、尪痹片低劑量組、仙靈骨葆膠囊組,甲氨蝶呤組,每組10只。尪痹片高劑量組(9630 mg/kg),尪痹片中劑量組(4815 mg/kg),尪痹片低劑量組(1070 mg/kg),仙靈骨葆膠囊組(1320 mg/kg),甲氨蝶呤組(11mg/kg),空白組給予生理鹽水2 mL,高劑量是人常規(guī)劑量的18倍,中劑量是人常規(guī)劑量的9倍,低劑量組、仙靈骨葆組和甲氨蝶呤組均為人常規(guī)劑量的5倍,連續(xù)給藥10日,每日一次。取血前禁食12小時,使用摘眼球取血法,取血后靜置30 min,放入離心機中低速離心3分鐘,分離血清與血細胞,棄血細胞,將血清置于-80℃冰箱保存。

        1.4 細胞培養(yǎng)

        待所用培養(yǎng)的細胞中有90%左右已經(jīng)生長,按4×103/cm2鋪1個96孔板,待細胞融合約50%時進行實驗;配置7種不同含藥血清成骨細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,正常對照組,空白血清組,尪痹片高劑量組,尪痹片中劑量組,尪痹片低劑量組,仙靈骨葆膠囊組,甲氨蝶呤組,除了正常對照組,其他培養(yǎng)基中均加入濃度為3.125ng/ml的TNF-α溶液,每個藥物3個復(fù)孔,96孔板細胞棄上清,用1×PBS洗2~3次,加入100 μL/孔對應(yīng)的含藥血清成骨細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,放入37℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng);每隔2 d換一次液,第7 d取出細胞,進行各項檢測。

        1.5 MTT法檢測細胞增殖率

        取出96孔板,棄液,加入30 μL/孔MTT,37℃ 作用24 h,棄MTT,加入150 μL/孔 DMSO,37℃恒溫震蕩儀孵育15min測OD540,分析結(jié)果。增殖率%=(1-(正常對照組OD值-實驗組OD值)/(正常對照組OD值-調(diào)零OD值))×100

        1.6 茜素紅染色法檢測成骨礦化情況

        ①成骨誘導(dǎo)分化結(jié)束后,棄細胞培養(yǎng)基,室溫固定30 min;②棄4%多聚甲醛,用用1×PBS洗2次,每孔加入500μL茜素化結(jié)束后,棄細胞培養(yǎng)基,用1×PBS洗2次,每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液,紅染液染色3min;③棄茜素紅染液,用1×PBS洗3~5次,將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

        1.7 堿性磷酸酶測試盒測試堿性磷酸酶活性

        原理:堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉,產(chǎn)生游離酚和磷酸,酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物,根據(jù)紅色深淺可以測定酶活力的高低。檢測步驟:按照堿性磷酸酶測試盒說明書的操作方法進行。

        2.統(tǒng)計學(xué)方法

        3.結(jié)果

        3.1 細胞增殖情況

        如圖1和表1所示,與正常組相比較,其他各組的增殖率均低于正常組(P<0.01),空白血清組與尪痹片低劑量組的增殖率的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),尪痹片低劑量組較高、中劑量組高(P<0.01),仙靈骨葆組與甲氨蝶呤組的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        表1 7組MTT檢測細胞增殖率

        圖1 MTT檢測細胞增殖率比較

        2.2 成骨鈣化結(jié)節(jié)情況

        茜素紅染色成骨細胞鈣化結(jié)節(jié)呈紅褐色,形狀多為圓形和橢圓形,少數(shù)為不規(guī)則形狀,由下圖2-圖8可見,尪痹片中劑量組(圖5),尪痹片低劑量組(圖6),仙靈骨葆組(圖7)的礦化結(jié)節(jié)相對其他組較多??瞻籽褰M(圖3),尪痹片高劑量組(圖4),甲氨蝶呤組(圖8)的礦化結(jié)節(jié)比較少。

        2.3 堿性磷酸酶活力情況

        見表2所示,與正常對照組和空白血清組相比較,尪痹片低劑量組的AKP均值顯著高于前二組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),仙靈骨葆組與空白血清組的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),甲氨蝶呤組與空白血清組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        表2 7組細胞堿性磷酸酶檢測值

        3.討論

        細胞堿性磷酸酶活力和礦化結(jié)節(jié)的形成是成骨細胞早期和中晚期分化的標(biāo)志,對BMSCs而言則是表明BMSCs骨向分化的特征[4]。本研究的模型為在成骨分化培養(yǎng)基中加入3.125ng/ml的腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α),是RA病程中最早產(chǎn)生的炎癥細胞因子之一,在發(fā)病機制中起主導(dǎo)作用,是炎癥瀑布的上游分子,通過作用于多種細胞在RA的滑膜炎癥、血管新生及骨質(zhì)破壞中起重要作用[5]。RA患者的血清中TNF-α水平顯著上調(diào),且與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活動性呈顯著正相關(guān)[6],在RA患者的關(guān)節(jié)液亦出現(xiàn)TNF-α的高表達[7]。本研究的結(jié)果提示,BMSCs細胞在炎癥因子和藥物的刺激之下,均出現(xiàn)了細胞增殖減少,尪痹片高,中劑量組對細胞增殖的阻礙作用比較大,尪痹片低劑量組對細胞增殖的阻礙作用比其他組低,甲氨蝶呤組和仙靈骨葆組均對細胞增殖有阻礙作用,但是其阻礙作用比尪痹片低劑量組要大。說明尪痹片的低劑量對細胞的毒性相對較小。在成骨分化標(biāo)志物方面,尪痹片中劑量組表現(xiàn)出堿性磷酸酶活力增加,茜素紅染色的鈣化結(jié)節(jié)明顯增多。表明尪痹片中劑量組對TNF-α刺激下的成骨分化保護作用較尪痹片其他劑量,仙靈骨葆膠囊和甲氨蝶呤效果好。RA主要為炎癥性關(guān)節(jié)病,但是又以伴發(fā)骨代謝異常骨質(zhì)疏松癥為特點,表現(xiàn)為關(guān)節(jié)周圍骨丟失及骨侵蝕、全身性骨質(zhì)疏松癥,患者的骨折風(fēng)險明顯增加[8]。骨質(zhì)疏松的原因之一在于骨生成不足[9],有報道稱尪痹片可以增加RA患者的骨密度以及骨鈣素、血清Ⅰ型膠原交聯(lián) C 末端肽等血清成骨標(biāo)志物。甲氨蝶呤并不能阻止骨質(zhì)疏松的發(fā)生[10]。本研究的結(jié)果進一步證實了尪痹片具有促進骨生成的作用,同時揭示導(dǎo)致這種促進作用的一條可能的機制是促進BMSCs向成骨分化,能夠保護TNF-α刺激下的BMSCs仍然具有成骨分化能力。

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