劉益臻 李立章 王炎 付坤飛

（貴州中醫(yī)藥大學 貴州 貴陽 550001）

尪痹片由著名國醫(yī)大師焦樹德教授創(chuàng)立，是國家六類新藥痹病系列藥之一，為中華中醫(yī)藥學會風濕病分會協定處方，臨床用于治療類風濕性關節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis,RA）療效顯著，病理研究和臨床研究均表明該藥可減輕骨破壞程度,促進骨形成[1,2]，骨形成的重要細胞為成骨細胞，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)可分化為成骨細胞[3]，因此本研究使用尪痹片含藥血清體外干預骨髓間充質干細胞，探討其對成骨分化的保護作用。

1.資料與方法

1.1 藥物與試劑

尪痹片，仙靈骨葆膠囊，甲氨蝶呤片，SD大鼠骨髓間充質干細胞株（中國科學院），成骨分化培養(yǎng)基，茜素紅，腫瘤壞死因子α，TNF-α，一步法快速WB（HRP）試劑盒，高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒，蛋白膜印跡再生液，TRNzol總RNA提取試劑，PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR?Premix Ex Taq ? Ⅱ,ROX plus，DL2,000 DNA Marker，康為世紀SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（CW0022），堿性磷酸酶（AKP）測試盒。

1.2 實驗儀器

No：164-5050電 泳 儀，Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System蛋白電泳槽，Mini Trans-Blot，蛋白轉印系統，TY-80脫色搖床。ZS-2板式酶標儀，202-2AB電熱恒溫箱，ABI7500熒光定量PCR儀，SK-D1807-E Analog 3D Shaker，RS-25S超聲波細胞粉碎機，LIDE 200掃描儀，ST60-4微孔板恒溫振蕩器，AUW-220D電子分析d平。

1.3 含藥血清的制備

清潔級SD大鼠雄性60只（中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，許可證號：SCXK2012-0011），隨機分成6組，每組10只，分別為空白組、尪痹片高劑量組、尪痹片中劑量組、尪痹片低劑量組、仙靈骨葆膠囊組，甲氨蝶呤組，每組10只。尪痹片高劑量組(9630 mg/kg)，尪痹片中劑量組(4815 mg/kg)，尪痹片低劑量組(1070 mg/kg)，仙靈骨葆膠囊組(1320 mg/kg)，甲氨蝶呤組(11mg/kg)，空白組給予生理鹽水2 mL,高劑量是人常規(guī)劑量的18倍，中劑量是人常規(guī)劑量的9倍，低劑量組、仙靈骨葆組和甲氨蝶呤組均為人常規(guī)劑量的5倍，連續(xù)給藥10日，每日一次。取血前禁食12小時，使用摘眼球取血法，取血后靜置30 min，放入離心機中低速離心3分鐘，分離血清與血細胞，棄血細胞，將血清置于-80℃冰箱保存。

1.4 細胞培養(yǎng)

待所用培養(yǎng)的細胞中有90%左右已經生長，按4×103/cm2鋪1個96孔板，待細胞融合約50%時進行實驗；配置7種不同含藥血清成骨細胞誘導分化培養(yǎng)基，正常對照組，空白血清組，尪痹片高劑量組，尪痹片中劑量組，尪痹片低劑量組，仙靈骨葆膠囊組，甲氨蝶呤組，除了正常對照組，其他培養(yǎng)基中均加入濃度為3.125ng/ml的TNF-α溶液，每個藥物3個復孔，96孔板細胞棄上清，用1×PBS洗2～3次，加入100 μL/孔對應的含藥血清成骨細胞誘導分化培養(yǎng)基，放入37℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每隔2 d換一次液，第7 d取出細胞，進行各項檢測。

1.5 MTT法檢測細胞增殖率

取出96孔板，棄液，加入30 μL/孔MTT，37℃ 作用24 h，棄MTT，加入150 μL/孔 DMSO，37℃恒溫震蕩儀孵育15min測OD540，分析結果。增殖率%＝（1-（正常對照組OD值-實驗組OD值）/（正常對照組OD值-調零OD值））×100

1.6 茜素紅染色法檢測成骨礦化情況

①成骨誘導分化結束后，棄細胞培養(yǎng)基，室溫固定30 min；②棄4%多聚甲醛，用用1×PBS洗2次，每孔加入500μL茜素化結束后，棄細胞培養(yǎng)基，用1×PBS洗2次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，紅染液染色3min；③棄茜素紅染液，用1×PBS洗3～5次，將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

1.7 堿性磷酸酶測試盒測試堿性磷酸酶活性

原理：堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉，產生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據紅色深淺可以測定酶活力的高低。檢測步驟：按照堿性磷酸酶測試盒說明書的操作方法進行。

2.統計學方法

3.結果

3.1 細胞增殖情況

如圖1和表1所示，與正常組相比較，其他各組的增殖率均低于正常組(P＜0.01)，空白血清組與尪痹片低劑量組的增殖率的差異沒有統計學意義(P＞0.05),尪痹片低劑量組較高、中劑量組高(P＜0.01)，仙靈骨葆組與甲氨蝶呤組的差異沒有統計學意義(P＞0.05)。

表1 7組MTT檢測細胞增殖率

圖1 MTT檢測細胞增殖率比較

2.2 成骨鈣化結節(jié)情況

茜素紅染色成骨細胞鈣化結節(jié)呈紅褐色,形狀多為圓形和橢圓形,少數為不規(guī)則形狀，由下圖2-圖8可見，尪痹片中劑量組（圖5）,尪痹片低劑量組（圖6）,仙靈骨葆組(圖7)的礦化結節(jié)相對其他組較多?？瞻籽褰M（圖3），尪痹片高劑量組（圖4），甲氨蝶呤組（圖8）的礦化結節(jié)比較少。

2.3 堿性磷酸酶活力情況

見表2所示，與正常對照組和空白血清組相比較，尪痹片低劑量組的AKP均值顯著高于前二組，差異具有統計學意義(P＜0.01），仙靈骨葆組與空白血清組的差異沒有統計學意義(P＞0.05)，甲氨蝶呤組與空白血清組之間的差異沒有統計學意義(P＞0.05)。

表2 7組細胞堿性磷酸酶檢測值

3.討論

細胞堿性磷酸酶活力和礦化結節(jié)的形成是成骨細胞早期和中晚期分化的標志,對BMSCs而言則是表明BMSCs骨向分化的特征[4]。本研究的模型為在成骨分化培養(yǎng)基中加入3.125ng/ml的腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor alpha，TNF-α），是RA病程中最早產生的炎癥細胞因子之一，在發(fā)病機制中起主導作用,是炎癥瀑布的上游分子,通過作用于多種細胞在RA的滑膜炎癥、血管新生及骨質破壞中起重要作用[5]。RA患者的血清中TNF-α水平顯著上調，且與類風濕性關節(jié)炎的活動性呈顯著正相關[6]，在RA患者的關節(jié)液亦出現TNF-α的高表達[7]。本研究的結果提示，BMSCs細胞在炎癥因子和藥物的刺激之下，均出現了細胞增殖減少,尪痹片高，中劑量組對細胞增殖的阻礙作用比較大，尪痹片低劑量組對細胞增殖的阻礙作用比其他組低，甲氨蝶呤組和仙靈骨葆組均對細胞增殖有阻礙作用，但是其阻礙作用比尪痹片低劑量組要大。說明尪痹片的低劑量對細胞的毒性相對較小。在成骨分化標志物方面，尪痹片中劑量組表現出堿性磷酸酶活力增加，茜素紅染色的鈣化結節(jié)明顯增多。表明尪痹片中劑量組對TNF-α刺激下的成骨分化保護作用較尪痹片其他劑量，仙靈骨葆膠囊和甲氨蝶呤效果好。RA主要為炎癥性關節(jié)病，但是又以伴發(fā)骨代謝異常骨質疏松癥為特點，表現為關節(jié)周圍骨丟失及骨侵蝕、全身性骨質疏松癥,患者的骨折風險明顯增加[8]。骨質疏松的原因之一在于骨生成不足[9]，有報道稱尪痹片可以增加RA患者的骨密度以及骨鈣素、血清Ⅰ型膠原交聯 C 末端肽等血清成骨標志物。甲氨蝶呤并不能阻止骨質疏松的發(fā)生[10]。本研究的結果進一步證實了尪痹片具有促進骨生成的作用，同時揭示導致這種促進作用的一條可能的機制是促進BMSCs向成骨分化，能夠保護TNF-α刺激下的BMSCs仍然具有成骨分化能力。