王 琳, 李璐璐, 劉瑞瑞, 李志英

(1.西安醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)系, 陜西 西安 710021; 2.西部生物資源與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710069)

在當(dāng)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，植物病原微生物是農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因之一[1]，所以對(duì)植物病原物的防治也顯得尤為重要。在以前，人們經(jīng)常使用化學(xué)農(nóng)藥來達(dá)到防治的目的，雖然這取得了不錯(cuò)的效果，但是也給環(huán)境和人民的健康帶來了潛在的威脅，同時(shí)也讓病原微生物有了抗性，產(chǎn)生了更多的環(huán)境問題。近年來，隨著綠色環(huán)保的倡議越來越多，對(duì)植物病害防治有顯著效果的生物防治也就脫穎而出，而其較于其他方式來說更加安全，零殘留，零污染，并且還具有生產(chǎn)成本低，不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)[2]?？股睾椭参镎T導(dǎo)劑以及拮抗微生物等都是生物防治劑，其中微生物的種類主要有細(xì)菌，真菌，放線菌和病毒等[3]。用來進(jìn)行生物防治的細(xì)菌主要有芽胞桿菌、假單胞桿菌和巴氏桿菌等[4]，其中芽孢桿菌由于其產(chǎn)生的芽孢具有耐熱、耐旱、抗紫外線的優(yōu)點(diǎn)，成為生防研究的重要菌種資源。芽孢桿菌種群龐大，繁殖能力強(qiáng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境要求低，在自然界廣泛分布，對(duì)環(huán)境無危害，容易分離培養(yǎng)，抑菌譜廣泛，在儲(chǔ)存、制作菌劑和運(yùn)輸方面都有著極強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)在用來進(jìn)行生物防治的芽孢桿菌有巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillus Pumilus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)等。

枯草芽孢桿菌大量存在于土壤和變質(zhì)的有機(jī)物中，且不止存在于植物的根、莖、葉的表面[5]，其根部和莖部組織內(nèi)也存在著內(nèi)生性芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌具有抑菌譜廣泛、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、繁殖能力強(qiáng)，還可以形成芽孢等優(yōu)點(diǎn)，在菌劑開發(fā)方面有著極大的優(yōu)勢(shì)。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)對(duì)枯草芽孢桿菌的生防菌種展開了大量的研究，并且取得了很大的成果，已經(jīng)有商品化的枯草芽孢桿菌菌劑上市。

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.1 菌種

表1 菌株情況

注:*“本實(shí)驗(yàn)室”指西部生物資源與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，瓊脂16 g，自然pH值。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂16 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 枯草芽孢桿菌Bs-W5菌落對(duì)植物病原菌抑菌活性測(cè)定

2.1.1 Bs-W5和植物病原菌的活化 在做抑菌實(shí)驗(yàn)前首先要對(duì)Bs-W5和植物病原菌進(jìn)行活化。Bs-W5活化：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30℃，30 h；真菌病原體活化：PDA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至菌落被一半平板覆蓋；細(xì)菌病原體活化：牛肉蛋白胨培養(yǎng)基，30℃，24 h?；罨瓿芍?，將Bs-W5、真菌病原體以及細(xì)菌病原體接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h，然后將其稀釋為不同的濃度以備后續(xù)使用[6]。

2.1.2 平板菌落對(duì)峙法 筆者研究使用平板菌落對(duì)峙法來測(cè)定枯草芽孢桿菌Bs-W5對(duì)植物病原菌的抑制活性[7]。測(cè)定方法：在配置好的PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿底部找到中心點(diǎn)，然后在其上劃十字線，將直徑為6 mm的病原菌菌餅接種到中心；將Bs-W5單菌落接種到距離中心30 mm的3個(gè)方向，剩余一個(gè)方向不接種Bs-W5菌落用作空白對(duì)照。在PDA培養(yǎng)基中心接種病原菌而在其他地方不接種Bs-W5來作為對(duì)照組。在對(duì)照組的病原菌鋪滿整個(gè)培養(yǎng)基平板時(shí)，再測(cè)量實(shí)驗(yàn)組中Bs-W5對(duì)不同致病菌的拮抗寬度。每組試驗(yàn)做3個(gè)重復(fù)。

2.1.3 抑制率的計(jì)算方法

抑制菌絲生長(zhǎng)率(%)

2.2 Bs-W5發(fā)酵液上清液對(duì)植物病原菌的抑制活性測(cè)定

2.2.1 Bs-W5發(fā)酵液上清液的制備和植物病原菌的活化 發(fā)酵液上清液的制備：將在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化后的菌株Bs-W5接種3環(huán)到種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)22 h(30℃)。然后以5%的接種量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中(錐形瓶裝液量100 mL·250 mL-1)，30℃，180 r·min-1搖瓶培養(yǎng)72 h，收集發(fā)酵液，12 000 r·min-1高速離心10 min，收集上清液，最后將收集到的上清液用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾器進(jìn)行過濾[9]，最后保存以備后續(xù)使用。

植物病原菌的活化：同2.1.1的植物病原菌活化。

2.2.2 牛津杯法 筆者研究使用牛津杯法來測(cè)定Bs-W5發(fā)酵液上清液幾種植物病原菌的抑制活性[10]。測(cè)定方法：在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)皿底部找到中心點(diǎn)之后劃出十字線，在中心點(diǎn)接種直徑為6 mm的病原菌菌餅，在距離中心30 mm處分別放置4個(gè)不同方向的牛津杯，在其中3個(gè)牛津杯中加入200 μL的發(fā)酵液上清液，在剩余一個(gè)牛津杯中加入200 μL無菌水作為對(duì)照。只在PDA培養(yǎng)基底部的中心接種病原體真菌餅的一組作為空白對(duì)照。在對(duì)照組的菌落鋪滿整個(gè)平板的時(shí)候，測(cè)量拮抗距離。每個(gè)實(shí)驗(yàn)三個(gè)重復(fù)。

2.2.3 抑制率 計(jì)算方法同2.1.3。

2.3 不同處理?xiàng)l件對(duì)發(fā)酵液上清液抑菌率穩(wěn)定性的影響

使用不同條件處理Bs-W5的發(fā)酵液上清液來測(cè)定其抑菌率的穩(wěn)定性，其中包括貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)、酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)、光照穩(wěn)定性試驗(yàn)和遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)[11]。測(cè)定抑菌率試驗(yàn)的植物病原菌選用抑菌率較大(53.98%)且生長(zhǎng)較快(4 d長(zhǎng)滿整個(gè)平板)的葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，測(cè)定的方法選用牛津杯法。抑菌率的計(jì)算方法同2.1.3。

2.3.1 貯存穩(wěn)定性試驗(yàn) 將之前備用的發(fā)酵液上清液(100 mL)取出，分成5等份，依次編號(hào)1，2，3，4和5，并以密封形式儲(chǔ)存。在密封放置15 d的時(shí)候，開始測(cè)定1號(hào)上清液的抑菌率，30 d的時(shí)候測(cè)定2號(hào)上清液的抑菌率，60 d的時(shí)候測(cè)定3號(hào)上清液的抑菌率，以此類推[12]。使用沒有任何處理的新鮮的發(fā)酵液上清液作為對(duì)照組。每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

2.3.2 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 將之前備用的發(fā)酵液上清液(100 mL)取出，分成5等份，依次編號(hào)1，2，3，4和5。1～4號(hào)分別在40℃、60℃、80℃、100℃的條件下分別處理60 min，將編號(hào)為5的樣品于120℃下處理20 min，冷卻至室溫，最終測(cè)定1～5號(hào)的抑菌率。使用沒有任何處理的新鮮的發(fā)酵液上清液作為對(duì)照組。每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

2.3.3 酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn) 取13等份20 mL的發(fā)酵液上清液，將其分別編號(hào)為1～13號(hào)。調(diào)節(jié)相應(yīng)的pH值(1 mol·L-1的HCl和1 mol·L-1的NaOH溶液)，處理12 h之后，再將pH值調(diào)節(jié)為初始的值(pH值為8)，并測(cè)定用不同pH值處理之后的上清液的抑制率。使用沒有任何處理的新鮮的發(fā)酵液上清液作為對(duì)照組。每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

2.3.4 光照穩(wěn)定性試驗(yàn) 取5等份20 mL的發(fā)酵液上清液，分別編號(hào)1、2、3、4、5號(hào)，多波段光照培養(yǎng)箱的光照強(qiáng)度設(shè)置為4 500±500 lx，然后以1～5號(hào)的順序分別在光照培養(yǎng)箱中照射2、4、6、8、10 d后，分別測(cè)定每組的抑菌率。使用沒有任何處理的新鮮的發(fā)酵液上清液作為對(duì)照組。每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

2.3.5 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 第一代菌種：活化之后的枯草芽孢桿菌Bs-W5[13]；第二代菌種：活化之后再培養(yǎng)20 h后，轉(zhuǎn)接到新的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌種，依此類推，培養(yǎng)10代。將2，4，6，8和10代的菌株通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72 h(12 000 r·min-1，10 min)之后，將收集到的上清液用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾器進(jìn)行過濾[14]，最后測(cè)出發(fā)酵液上清液的抑菌率。第一代菌株的發(fā)酵液上清液為對(duì)照組，每組3次重復(fù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 Bs-W5菌落對(duì)不同植物病原菌的抑制作用

在測(cè)定菌落對(duì)不同植物病原菌的抑制作用時(shí)采用的平板菌落對(duì)峙法可以直觀的反映出拮抗菌的拮抗能力[15]。平板菌落對(duì)峙法可以在平板上清晰的觀察到抑菌圈及拮抗寬度，是一種操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)的拮抗測(cè)定方法。Bs-W5對(duì)不同致病菌的抑制率如表2所示。

表2 Bs-W5對(duì)不同病原菌的抑制率

由表2得出，Bs-W5對(duì)九種植物病原真菌和兩種病原細(xì)菌都有比較強(qiáng)烈的拮抗作用。而上述幾種拮抗作用中，Bs-W5對(duì)番茄灰霉病菌的拮抗作用達(dá)到了71.02%，對(duì)腐皮鐮刀菌的拮抗作用達(dá)到65.88%，是對(duì)九種病原真菌中拮抗能力最強(qiáng)的。而對(duì)其他的病原真菌的抑制率也都高于50%。在對(duì)兩種病原細(xì)菌的拮抗作用中，Bs-W5對(duì)金黃色葡萄球菌的拮抗作用比大腸桿菌的要強(qiáng)一些。上述研究表明枯草芽孢桿菌Bs-W5不只可以對(duì)植物病原真菌有著較強(qiáng)的拮抗作用，也對(duì)部分病原細(xì)菌存在拮抗作用。

枯草芽孢桿菌Bs-W5對(duì)部分植物病原菌的拮抗效果如下圖所示。

圖1 枯草芽孢桿菌Bs-W5對(duì)楊樹潰瘍病菌的抑制作用

圖2 枯草芽孢桿菌Bs-W5對(duì)葡萄座腔菌的抑制作用

圖3 枯草芽孢桿菌Bs-W5對(duì)甜瓜枯萎病原菌的抑制作用

圖4 枯草芽孢桿菌Bs-W5對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病原菌的抑制作用

圖5 枯草芽孢桿菌Bs-W5對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用

圖6 枯草芽孢桿菌Bs-W5對(duì)黑曲霉的抑制作用

圖7 枯草芽孢桿菌Bs-W5對(duì)米曲霉菌的抑制作用

圖8 枯草芽孢桿菌Bs-W5對(duì)金黃色葡萄球菌

從以上Bs-W5菌落在PDA平板上對(duì)不同病原菌的拮抗圖可以看到，無論是在培養(yǎng)基的表面還是在培養(yǎng)基內(nèi)部，Bs-W5對(duì)不同病原菌都有較為強(qiáng)烈的抑制作用。同時(shí)也可以觀察到枯草芽孢桿菌Bs-W5具有很強(qiáng)的繁殖能力，在PDA平板上形成的菌落很大，說明Bs-W5不僅可以分泌抗菌物質(zhì)對(duì)病原菌形成抑制作用，而且在生存空間和營(yíng)養(yǎng)方面對(duì)病原菌也有著很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)作用。

3.2 枯草芽孢桿菌Bs-W5發(fā)酵液上清液對(duì)不同植物病原菌的抑制作用

發(fā)酵液的上清液中存在著菌體生長(zhǎng)過程中分泌的各種物質(zhì)，其中Bs-W5分泌的各種抑菌物質(zhì)對(duì)其抑菌作用起著重要作用，而發(fā)酵液上清液中抑菌物質(zhì)的拮抗性的測(cè)定則使用的是牛津杯法[16]。結(jié)果如表3所示。

由表3得出，Bs-W5發(fā)酵液上清液對(duì)植物病原菌的抑制作用也較為強(qiáng)烈，其中對(duì)番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的抑制作用達(dá)到了66.26%，是上述幾種抑菌作用中最強(qiáng)的，而表2中運(yùn)用平板菌落對(duì)峙法所測(cè)得的結(jié)果也是對(duì)番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的抑制作用最強(qiáng)，其次對(duì)葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的抑制作用較好，為53.98%。兩種抑制方式相比，Bs-W5發(fā)酵液上清液的抑制率低于菌落的抑制率。這表明Bs - W5發(fā)酵液上清液的抑菌能力弱于菌落，這意味著雖然上清液中有抗菌物質(zhì)，但是因?yàn)槠桨寰鋵?duì)峙法中菌落不僅分泌抗菌物質(zhì)，而且也對(duì)病原真菌形成一種生物競(jìng)爭(zhēng)作用，所以兩種抑制機(jī)制的共同作用下，使得菌落的抑菌性更強(qiáng)。

牛津杯法對(duì)部分植物病原菌的抑制作用如下所示。

表3 Bs-W5發(fā)酵液上清液對(duì)植物病原菌的抑制率

圖9 Bs-W5發(fā)酵上清液對(duì)葡萄座腔菌 的抑制作用

圖10 Bs-W5發(fā)酵上清液對(duì)蘋果腐爛菌的抑制作用

圖11 Bs-W5發(fā)酵上清液對(duì)腐皮鐮刀菌的抑制作用

圖12 Bs-W5發(fā)酵上清液對(duì)楊樹潰瘍病菌的抑制作用

圖13 Bs-W5發(fā)酵上清液對(duì)甜瓜枯萎病的抑制作用

圖14 Bs-W5發(fā)酵上清液對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用

上述圖片表明，Bs-W5的發(fā)酵液上清液對(duì)植物病原菌有著較強(qiáng)的抑制作用。所以，不僅可以利用發(fā)酵液中的活細(xì)菌和孢子來進(jìn)行生物防治，還可以將上清液當(dāng)中的拮抗物質(zhì)用于生物防治。

3.3 不同條件處理對(duì)發(fā)酵液上清液抑菌率穩(wěn)定性的影響

(1)貯存穩(wěn)定性。由于枯草芽孢桿菌Bs-W5發(fā)酵液上清液中的拮抗物質(zhì)主要成分為蛋白質(zhì)，所以如果放置時(shí)間過長(zhǎng)的話就會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)變性或者沉淀等問題，以至于其抑菌作用也會(huì)受到相應(yīng)的影響。所以對(duì)其發(fā)酵液上清液的貯存穩(wěn)定性的試驗(yàn)是有必要的，試驗(yàn)結(jié)果如圖15所示。

圖15 存放時(shí)間對(duì)Bs-W5發(fā)酵液上清液抑菌率的影響

由圖15得出，Bs-W5發(fā)酵液上清液存放的前15 d，對(duì)其抑菌率沒有明顯影響，存放30 d之后，其抑菌率就開始下滑。在30～60 d的這段時(shí)間抑菌率降低最明顯，60 d之后抑菌率不到原來的一半。當(dāng)存放天數(shù)達(dá)到180 d的時(shí)候，菌株發(fā)酵液上清液的抑菌性幾乎消失。這就說明當(dāng)存放天數(shù)超過15 d后，發(fā)酵液上清液的抑菌性就開始逐漸的降低，直至最后幾乎沒有抑菌作用。這可能是因?yàn)?5 d之后抑菌蛋白開始出現(xiàn)變性、沉淀等現(xiàn)象，使得抑菌物質(zhì)的活性降低，導(dǎo)致上清液的抑菌率穩(wěn)定性發(fā)生變化。

(2)熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。不同溫度處理之后的發(fā)酵液上清液的抑菌率如圖16所示。

圖16 不同溫度對(duì)Bs-W5發(fā)酵液上清液的抑菌率的影響

由圖16得出，在40℃的條件下處理過后，和對(duì)照組的抑菌率幾乎無差別，當(dāng)處理溫度超過40℃，發(fā)酵液上清液的抑菌率開始下降，超過80℃之后抑菌率迅速下降，直到溫度達(dá)到120℃的時(shí)候，上清液當(dāng)中的抑菌率為0%。由此可見，發(fā)酵液上清液中的抑菌物質(zhì)不耐高溫，保存時(shí)要注意溫度的控制。

(3)酸堿穩(wěn)定性。酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)可以了解Bs-W5發(fā)酵液上清液中的抑菌物質(zhì)對(duì)酸堿的耐受程度，來防止在提取分離的步驟中使用了不當(dāng)?shù)膒H值而使抑菌物質(zhì)失活，這對(duì)以后抗菌物質(zhì)提取、分離、純化以及鑒定都有著重大意義[17]。不同pH值處理過的上清液的抑菌率如圖17所示。

圖17 不同pH值對(duì)Bs-W5發(fā)酵液上清液抑菌率的影響

由圖17得出，Bs-W5發(fā)酵液上清液在pH值為7～9時(shí)，抑菌率一直保持較高水平。當(dāng)pH值為9～11時(shí)，上清液的抑菌率隨pH值的升高而降低。當(dāng)pH值超過11時(shí)，上清液中的拮抗物質(zhì)在堿性條件下變性失活而使抑菌率迅速的下降。而當(dāng)pH值低于7時(shí)，上清液的抑菌率隨著pH值的減小而減小，同時(shí)上清液當(dāng)中存在少量的沉淀物質(zhì)。這可能是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，上清液中的拮抗物質(zhì)形成了不可溶性沉淀所致[18]。

(4)光照穩(wěn)定性。研究抗菌物質(zhì)的所有過程都是在有光照的條件下進(jìn)行，所以要對(duì)Bs-W5的光照穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)，以便后續(xù)試驗(yàn)得出更加準(zhǔn)確的結(jié)果[19]。不同光照時(shí)間對(duì)上清液的抑菌率影響如圖18所示。

圖18 光照天數(shù)對(duì)Bs-W5發(fā)酵液上清液抑菌率的影響

由圖18得出，在經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間光照照射之后，抑菌率比較穩(wěn)定，依然保持在原有水平。這就說明Bs-W5所分泌的抗菌物質(zhì)是不受光照影響的[20]，可以在大田試驗(yàn)中直接施用，而不必?fù)?dān)心光照所帶來的影響。

(5)遺傳穩(wěn)定性。Bs-W5作為一株生防菌種，則其必須具有抑菌性能遺傳穩(wěn)定性，以防止在使用過程中出現(xiàn)變異等情況，使得其抑菌性能受到影響。其遺傳穩(wěn)定性如圖19所示。

圖19 傳代次數(shù)對(duì)Bs-W5發(fā)酵液上清液抑菌率的影響

從圖19的結(jié)果可以看到，在Bs-W5傳代10代培養(yǎng)的過程中，其發(fā)酵液上清液的抑菌率保持較高的穩(wěn)定性，這就說明菌種枯草芽孢桿菌Bs-W5有著很好的遺傳穩(wěn)定性，值得以后繼續(xù)深入的研究，以充分發(fā)掘其生防能力[21]。