普境安說(shuō)明：“普境安”主要成分為磷酸鹽化合物（85%）、鈣、鐵、硫酸鹽（2.6%）、活性氯、Perica 油（0.05%）和鋁硅酸鹽（10.1%）?！捌站嘲病本哂泻軓?qiáng)地降低病毒滴度，還可以降低大量細(xì)菌作用。減少微生物吸附造成的對(duì)表面微生物污染的作用，吸附地板上的水和尿素，減少氮排放，稍微的防臭作用使“普境安”適合用作很好的衛(wèi)生材料。

評(píng)價(jià)目的：偽狂犬病病毒和禽痘病毒與非洲豬瘟病毒的分子結(jié)構(gòu)相似，都是雙股DNA 病毒，并且同是高接觸性傳染病，評(píng)價(jià)“普境安”體外降低偽狂犬病病毒、禽痘病毒活性效果的同時(shí)也為“普境安”降低非洲豬瘟病毒的活性提供有力依據(jù)。

評(píng)價(jià)方法：將“普境安”消毒劑設(shè)置梯度使用劑量（1/2 推薦劑量、推薦劑量、2×推薦劑量）在不同溫度（4 ℃、16 ℃、37 ℃）、不同時(shí)間（5 min、15 min、30 min、45 min）、不同環(huán)境和偽狂犬病病毒（PRV）、禽痘病毒（FPV）分別作用后測(cè)病毒TCID50，抽提核酸后用熒光定量PCR 方法檢測(cè)病毒核酸含量，觀(guān)察“普境安”對(duì)偽狂犬病病毒和禽痘病毒的吸附效果。模擬消毒劑使用的現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境（土壤、水泥地、糞便）和偽狂犬病病毒、禽痘病毒分別混合后再使用“普境安”干粉消毒劑作用，分別設(shè)置3 個(gè)變量（劑量、溫度、時(shí)間）檢測(cè)不同情況下“普境安”干粉消毒劑吸附病毒、降低病毒活性的作用。

本試驗(yàn)于2019年6 月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)中心完成

1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1 毒株

豬偽狂犬病病毒（PRV-XJ），保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心；禽痘病毒毒株，保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心。

1.2 主要試劑

胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM 培養(yǎng)液）、胰蛋白酶、PBS緩沖液、PK-15 細(xì)胞，雞胚成纖維細(xì)胞，熒光PCR 引物，均由實(shí)驗(yàn)室提供；“普境安”消毒劑由丹麥（Storm?llen 公司）、成都杰鑫瑪生物科技有限公司生產(chǎn)提供。

2 消毒劑安全評(píng)估結(jié)果

2.1 偽狂犬病病毒和禽痘病毒滴度測(cè)定

2.1.1 病毒液制備

將偽狂犬病病毒液和禽痘病毒液按常規(guī)操作分別接種于生長(zhǎng)良好的PK15 細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)病毒發(fā)生70%～80%感染時(shí)，將病毒液反復(fù)凍融 2 ～3 次，收集病毒液離心取上清，分裝于2 mL EP 管中。

2.1.2 測(cè)定偽狂犬病病毒和禽痘病毒的 TCID50

取上述制備好的病毒懸液用無(wú)血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行10系列的稀釋?zhuān)?0-1～10-10），分別接種于長(zhǎng)滿(mǎn)單層PK-15 細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞的96 孔培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100 μL 的病毒懸液；用含2% PBS的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液作為對(duì)照，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀(guān)察細(xì)胞有無(wú)細(xì)胞病變（CPE）變化并記錄結(jié)果。按Reed-Muench 法計(jì)算病毒的TCID50。

2.1.3 偽狂犬病病毒和禽痘病毒滴度測(cè)定結(jié)果

病毒滅活滴度用半數(shù)細(xì)胞感染劑量（TCID50）表示。計(jì)算公式如下：

TCID50對(duì)數(shù)值=病變率高于 50%組稀釋度的對(duì)數(shù)值+距離比例（“病變率高于 50%組”是指病變率超過(guò) 50%的最低組，下面均簡(jiǎn)稱(chēng)“高于 50%組”；“病變率低于 50%組”是指病變率低于 50%的最高組，下面均簡(jiǎn)稱(chēng)“低于50%組”）。

表1 偽狂犬病毒滴度測(cè)定結(jié)果

表 2 禽痘病毒滴度測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表1 和表2 中結(jié)果，按Reed-Muend 法計(jì)算出偽狂犬病病毒的TCID50值為10-8.21/0.1 mL ,禽痘病毒的TCID50值為10-6.73/0.025 mL。

2.2 “普境安”消毒劑接觸時(shí)間對(duì)禽痘病毒和偽狂犬病病毒體外殺滅效果測(cè)試

取288 個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿，一半培養(yǎng)皿（108 個(gè)試驗(yàn)組+36 個(gè)對(duì)照組）涂1 mL 禽痘病毒液，另一半培養(yǎng)皿（108 個(gè)試驗(yàn)組＋36 個(gè)對(duì)照組）涂1 mL 偽狂犬病病毒液后放于 37℃無(wú)菌恒溫箱干燥。向已干燥的病毒培養(yǎng)皿中以 25 g/m2，50 g/m2，100g/m2劑量加入粉劑“普境安”，在 4℃、16℃、37℃條件下使消毒劑單獨(dú)與等份的病毒保持接觸5 min，15 min，30 min，45 min（試驗(yàn)組每組設(shè)置3 組重復(fù)，最后取平均值，不同溫度下不同時(shí)間設(shè)置空白對(duì)照組無(wú)消毒劑作用也做3 組重復(fù)）。后將“普境安”干粉移除，用1 mL DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸收集培養(yǎng)皿中的病毒，做梯度稀釋后測(cè)定試驗(yàn)組與對(duì)照組的TCID50對(duì)比病毒滴度的差異。

試驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)表3），“普境安”粉狀消毒劑受溫度的影響較小，在不同的濃度和環(huán)境溫度下對(duì)病毒均有很好的殺滅作用，在接觸15 min 后滴度減少平均達(dá)到4 以上，在作用30 min 后滴度減少平均達(dá)到5 以上，但在推薦劑量時(shí)殺滅效果最佳。

2.3 熒光定量檢測(cè)“普境安”對(duì)禽痘病毒和偽狂犬病病毒體吸附效果

取288 個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿，一半培養(yǎng)皿（108 個(gè)試驗(yàn)組＋36 個(gè)對(duì)照組）涂1 mL 禽痘病毒液，另一半培養(yǎng)皿（108 個(gè)試驗(yàn)組+36 個(gè)對(duì)照組）涂1 mL 偽狂犬病病毒液后放于37 ℃無(wú)菌恒溫箱干燥。向已干燥的病毒培養(yǎng)皿中以 25 g/m2，50 g/m2，100g/m2劑量加入粉劑“普境安”，在4 ℃、16 ℃、37 ℃條件下使消毒劑單獨(dú)與等份的病毒保 持 接 觸 5 min，15 min，30 min，45 min（試驗(yàn)組每組設(shè)置3 組重復(fù)，最后取平均值，不同溫度下不同時(shí)間設(shè)置空白對(duì)照組無(wú)消毒劑作用也做3 組重復(fù)）。后將“普境安”干粉移除，用1 mL DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液重新懸浮收集培養(yǎng)皿中的干燥病毒，抽提病毒DNA，檢測(cè)DNA 濃度。梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品（即病毒原液）及待測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，檢測(cè)對(duì)照組和試驗(yàn)組病毒核酸含量，對(duì)比差異。

試驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)表4），“普境安”粉狀消毒劑可在不同溫度和濃度下均可有效吸附環(huán)境中的病毒，在移除普境安粉末的同時(shí)能移除大量病毒，其受溫度影響較小，推薦劑量在接觸15min 以上能大幅降低病毒量，達(dá)到較好的清除效果。

2.4 “普境安”消毒劑在土壤環(huán)境中對(duì)病毒的吸附效果

試驗(yàn)設(shè)置 A、B 組，每組3個(gè)重復(fù)，A 為偽狂犬病病毒組：5×5×5 cm3的土壤中加 2 mL 偽狂犬病病毒原液；B 為禽痘病毒組：5×5×5 cm3的土壤中加 2 mL 禽痘病毒原液，同樣在不同溫度不同時(shí)間下設(shè)置空白對(duì)照組無(wú)消毒劑作用也做3 組重復(fù)。每組分別設(shè)置4 ℃、16 ℃、37 ℃3 個(gè)溫度梯度，每個(gè)溫度下以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2的量加入粉劑“普境安”，作用 5 min、15 min、30 min、45 min 后用生理鹽水將土壤溶解，4 000 r/min 離心5 min 取上清，然后將上清做梯度稀釋檢測(cè)病毒滴度，對(duì)比消毒劑處理前后病毒滴度的差異。

表 3 “普境安”對(duì)禽痘病毒和偽狂犬病毒作用后TCID50 結(jié)果

表 4 “普境安”對(duì)禽痘病毒和偽狂犬病病毒作用后熒光定量試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)表5），在土壤環(huán)境中，“普境安”粉狀消毒劑在不同溫度差異較小，在不同的濃度和環(huán)境溫度下對(duì)病毒均有很好的殺滅作用，在接觸5 min 后大幅度降低病毒滴度，在接觸15 min 后病毒滴度平均降低4 以上。

2.5 “普境安”消毒劑對(duì)糞便環(huán)境中病毒的吸附效果

試驗(yàn)設(shè)置 A、B 組，每組3個(gè)重復(fù)，A 為偽狂犬病病毒組：5×5×5 cm3糞 便 加 2 mL PRV病毒原液；B 為禽痘病毒組：5×5×5 cm3糞 便 加2 mL FPV 病毒原液，同樣在不同溫度不同時(shí)間下設(shè)置空白對(duì)照組無(wú)消毒劑作用也做3 組重復(fù)。每組分別設(shè)置 4 ℃、16 ℃、37 ℃3 個(gè)溫度梯度，每個(gè)溫度下以25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2的量加入粉劑“普境安”，作用5 min、15 min、30 min、45 min 后 用 生 理鹽水將土壤溶解，4 000 r/min 離心5 min 取上清，然后將上清做梯度稀釋檢測(cè)病毒滴度，對(duì)比消毒劑處理前后病毒滴度的差異。

試驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)表6），在糞便環(huán)境中，“普境安”粉狀消毒劑在不同溫度差異較小，在不同的濃度和環(huán)境溫度下對(duì)病毒均有很好的殺滅作用，在接觸15 min 后病毒滴度平均降低4 以上。

表 5 土壤環(huán)境試驗(yàn) TCID50 結(jié)果

表 6 糞便環(huán)境試驗(yàn) TCID50 結(jié)果

2.6 “普境安”消毒劑對(duì)水泥地面環(huán)境中病毒的吸附效果

試驗(yàn)設(shè)置A、B 組，每組3個(gè)重復(fù)，A 為偽狂犬病病毒組：100 cm2的水泥地面上加 2 mL PRV病毒原液；B 為禽痘病毒組：100 cm2的水泥地面加2 mL FPV 病毒原液，同樣在不同溫度不同時(shí)間下設(shè)置空白對(duì)照組無(wú)消毒劑作用也做3 組重復(fù)。待病毒液干后，每組分別設(shè)置4 ℃、16 ℃、37 ℃3 個(gè)溫度梯度，每個(gè)溫度下以25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2的量加入粉劑“普境安”，作用5 min、15 min、30min、45 min 后移除“普境安”，用生理鹽水沖洗地面后將其收集。然后做梯度稀釋檢測(cè)病毒滴度，對(duì)比消毒劑處理前后病毒滴度的差異。

試驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)表7），在水泥地面環(huán)境中，“普境安”粉狀消毒劑在不同溫度差異較小，在不同的濃度和環(huán)境溫度下對(duì)病毒均有很好的殺滅作用，在接觸15min 后病毒滴度平均降低4 以上。

表 7水泥地面環(huán)境下試驗(yàn) TCID50 結(jié)果

3 評(píng)價(jià)情況總結(jié)

結(jié)果顯示“普境安”消毒劑對(duì)偽狂犬病病毒和禽痘病毒有很好的滅活作用，不同溫度對(duì)其滅活作用影響不大，建議使用推薦劑量。模擬消毒劑使用的現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境試驗(yàn)中“普境安”對(duì)兩種病毒都有很好的滅活效果，可以為其使用提供參考依據(jù)。

綜合評(píng)定認(rèn)為“普境安”消毒劑對(duì)環(huán)境中病毒有很好的滅活作用，可以用于生產(chǎn)消毒。