王 磊

（天津市獸藥飼料監(jiān)察所，天津 300402）

抗生素是養(yǎng)豬業(yè)臨床上應用最為廣泛的藥物 ,但由于用藥誤區(qū)，使得養(yǎng)豬場濫用抗生素的現象十分嚴重 ,至使藥物不良反應和耐藥菌株逐年增多，因而對豬病的預防和治療工作帶來很大困難[1]。據權威機構報道，濫用抗生素產生藥物殘留也嚴重威脅著食品安全。農業(yè)農村部在2018年4 月20日啟動了“獸用抗菌藥使用減量化行動”試點工作，旨在減少獸用抗生素對生豬養(yǎng)殖業(yè)和食品安全的危害。

現代中藥研究表明，多種中藥的有效成分具有治療常見豬病的作用，而且其不易產生耐藥性，對人體的毒副作用小。本實驗旨在篩選對于生豬養(yǎng)殖中豬源大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌有體外抑制作用，同時對飼料中的益生菌—枯草芽孢桿菌抑制作用小的中藥提取物，用以替代獸用抗生素。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

生物堿類：黃柏小檗堿、苦參堿；香豆素類：白芷香豆素；皂苷類：三七總皂苷（購自中國藥品生物制品檢定所）、三七葉皂苷、皂莢皂苷、仙人掌皂苷、土茯苓皂苷；青霉素（購自哈藥六廠）。

1.2 實驗菌株

豬源大腸埃希菌,金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 皂苷的提取分離

正丁醇萃取法，分段沉淀法[2]

1.3.2 生物堿的提取分離

聲波提取法[2]

1.3.3 香豆素提取分離

堿溶酸沉法[2]

1.3.4 藥敏片的制備

取定性濾紙，制作成6 mm 的圓片，高壓滅菌后烘干。將中藥提取 物 制 成10 μg/μL 藥 液，取2 mL藥液，將滅菌紙片分別浸泡2 h，將浸泡好的紙片烘干備用。陽性對照藥敏片由濃度為2.5 μg/μL 的青霉素同法浸泡制成。

1.3.5 菌液的制備

分別取實驗菌，在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，制成菌液。

1.3.6 抑菌實驗方法：Kirby-Bauer 紙片擴散法[3]

取內徑90 mm 的平底雙碟，加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,備用。菌液分別稀釋100 倍,抽取100 μL菌液注入到培養(yǎng)基上，用涂菌棒涂布均勻，待干燥后，貼上備好的藥敏片。將其置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中18 h 后，量取抑菌圈直徑，計算標準方差。

2 中藥提取物體外抑菌結果及分析

8 種中藥提取物體外抑菌結果如表1 所示。

從表1 中可見，8 種中藥提取物均有不同程度的抑菌作用。

對大腸埃希菌而言，8 種中藥提取物對其均有抑制作用，但抑制作用最好的是土茯苓皂苷，效果要好于陽性對照青霉素（抑菌圈直徑為14.30 mm）,其抑菌圈直徑為17.00 mm，其他中藥提取物對大腸埃希菌的抑制效果均未超過青霉素。

對金黃色葡萄球菌抑制作用最好的是白芷香豆素，其抑菌圈直徑為10.00 mm。抑菌程度稍遜于陽性對照（抑菌圈直徑為12.70 mm）。

苦參堿、皂莢皂苷和三七葉皂苷對枯草芽孢桿菌的抑制作用差不多，抑菌圈直徑均達到10 mm。

生物堿類中藥提取物（黃柏小檗堿、苦參堿）對三種實驗菌都有抑制作用，但抑菌效果不及陽性對照。香豆素類中藥提取物對三種實驗菌的抑制作用與生物堿類差不多，抑菌效果也弱于陽性對照。皂苷中藥提取物對三種實驗菌的抑制作用差別較大，三七葉皂苷和三七總皂苷兩種中藥提取物的抑菌效果相較于生物堿類及香豆素類提取物抑菌效果相當；其他三種皂苷類中藥提取物對個別實驗菌表現出了不抑制現象，皂莢皂苷和仙人掌皂苷對金黃色葡萄球菌沒有抑制作用，土茯苓皂苷對枯草芽胞桿菌沒有抑制作用。

表1 8 種中藥提取物體外抑菌結果

3 討論

3.1 從中藥提取物的分類看抑菌效果

上述8 種中藥提取物是根據中藥的療效選擇出來，再根據其有效成分的化學性質選擇適當的方法提取而得。本實驗旨在找到既能替代治療豬病的抗生素又對生豬的益生菌—枯草芽胞桿菌無抑制作用的中藥提取物，由實驗結果來看生物堿類中藥提取物（黃柏小檗堿和苦參堿）和香豆素類中藥提取物（本實驗只選取白芷香豆素）對三種試驗菌都有抑制作用。皂苷類中藥提取物（本研究選擇了5 種植物皂苷加以實驗研究）抑菌效果有選擇性，土茯苓皂苷對枯草芽胞桿菌沒有抑制作用，值得進一步研究。

3.2 抑菌效果的特異性和廣譜性

如實驗結果所示，土茯苓皂苷抑制大腸埃希菌的能力超過了陽性對照，而它對枯草芽孢桿菌沒有抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑制作用一般（與其他中藥提取物的抑菌結果比較）。這一結果達到了本次實驗的目的，因為陽性對照青霉素雖然對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，但同時也抑制了枯草芽胞桿菌的生長。抑制枯草芽胞桿菌會造成生豬食欲不振，影響生豬的生長速度?？梢钥紤]將土茯苓皂苷做為特異抗菌性的藥物替代廣譜抗生素使用。這樣既達到甚至超過了抗生素對生豬疾病的治療效果，又避免了抗生素對于生豬養(yǎng)殖的危害，一舉兩得。

其他類的中藥提取物對3 種實驗菌都有不同抑制作用，并由于其具有獸用抗生素沒有的，在生豬體內殘留低的特點，也有繼續(xù)研究的價值。

3.3 對有效成分粗提物可繼續(xù)深入研究，提升應用價值

中藥的作用機制十分復雜，本實驗是中藥粗提物對生豬常見致病菌的體外抑菌實驗研究，對于具有特異抑菌性和廣譜抑菌性的中藥提取物可通過分離純化技術進一步深入研究，從而確定其具體的抑菌成分，進而研究其抑菌作用機制。此外，還可以通過純化技術提高中藥提取物的含量，這樣由于其毒副作用小，含量的提高可能會提高其抑菌能力，抑菌效果可能會遠遠超過生豬養(yǎng)殖中常用的獸用抗菌素，很有開發(fā)前景。

3.4 研究方法和陽性對照的選擇

本實驗選用藥敏紙片法檢測中藥提取物抑菌活性。常用的抑菌實驗方法還包括牛津杯法、最小抑菌濃度測定法等。為了考察中藥提取物的抑菌穩(wěn)定性，可以選擇其他方法共同來檢測。但應注意每種方法藥物濃度的一致性。

本研究的陽性對照只選取青霉素，對于中藥提取物特異性和廣譜性抑菌效果的考察還應選取其他種類治療豬病的獸用抗菌素進行對照研究。通過不同類型治療豬病的獸用抗菌藥的共同比對試驗，有助于檢驗中藥提取物的抑菌能力。