王小紅 江洪 丁藝暉 羅聰

肺癌在我國(guó)居民惡性腫瘤發(fā)病率中居于首位[1]，研究抗肺癌的新療法具有重要意義。多西紫杉醇（docetaxel，DOC）具有較好的抗肺癌效果，常作為二線化療藥物用于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的單藥[2]和聯(lián)合治療[3-4]，其抗癌機(jī)制主要是阻滯細(xì)胞周期，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。但是單一藥物化療會(huì)產(chǎn)生耐藥性，即使初期癌細(xì)胞迅速被殺滅，腫瘤體積明顯縮小，多次反復(fù)使用后癌細(xì)胞由于基因突變而產(chǎn)生化療抵抗（耐藥性），是腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后不佳的主要原因?；熕幬锏陌悬c(diǎn)是腫瘤細(xì)胞，但腫瘤細(xì)胞周圍的微環(huán)境也參與化療抵抗的形成，特別是髓源抑制性細(xì)胞（MDSC）參與腫瘤微環(huán)境中免疫負(fù)調(diào)控的形成[5]。腫瘤細(xì)胞還會(huì)分泌CXCL-5主動(dòng)招募MDSC進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，MDSC會(huì)分泌IL-23參與化療抵抗[6]，基于這一機(jī)制，靶向MDSC的臨床應(yīng)用正成為惡性腫瘤治療的新策略[7-8]。竹蓀多糖具有誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞[9]和骨肉瘤細(xì)胞[10]發(fā)生凋亡的效應(yīng)，竹蓀多糖組分也有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的效應(yīng)[11]。本研究聯(lián)合應(yīng)用竹蓀多糖組分ZSP1與DOC以期降低化療抵抗，提高肺癌的治療效果，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 化學(xué)試劑和儀器 竹蓀粗多糖購(gòu)自杭州眾芝康菇公司，ZSP1由本實(shí)驗(yàn)室自行制備；DOC（批號(hào)：180406AF，規(guī)格：每支20mg/0.5ml）購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；流式抗體（FITC-CD11b、APC-Gr1）均購(gòu)自美國(guó) BD公司；Western blot抗體（Anti-IL12、Anti-茁-actin）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；合成引物購(gòu)自北京中美泰和公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，PrimeScript RT Master Mix購(gòu)自日本 TaKaRa公司；SYBR Green域Mix購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）購(gòu)自美國(guó)BD公司；Western blot檢測(cè)顯色成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。檢測(cè)步驟嚴(yán)格參照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組、建模和治療 C57小鼠40只，鼠齡6～8周，體重18～22g；均購(gòu)自北京維通利華公司。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（應(yīng)用0.9%氯化鈉注射液）、ZSP1組、DOC組和ZSP1+DOC（聯(lián)用組），每組10只，皮下注射路易斯肺癌（LLC）腫瘤細(xì)胞懸液100滋l（含腫瘤細(xì)胞5伊105個(gè)），當(dāng)天即開(kāi)始藥物干預(yù)，ZSP1組小鼠腹腔注射ZSP1 10mg/kg，DOC組小鼠腹腔注射DOC2mg/kg，聯(lián)用組腹腔注射相同劑量竹蓀多糖組分ZSP1和DOC，上述藥物均溶于100滋l的0.9%氯化鈉注射液，對(duì)照組注射100滋l的0.9%氯化鈉注射液，均隔日1次，開(kāi)始治療第10、12、15天記錄腫瘤體積。另再選取Toll樣受體4（TLR4）基因敲除的C57小鼠（TLR4KO組）和野生型C57小鼠（WT組）各10只，鼠齡6～8周，體重18～22g；均購(gòu)自北京維通利華公司進(jìn)行抗腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。該兩組小鼠均用竹蓀多糖組分ZSP1和DOC混合液灌胃（劑量和配置方法同上述聯(lián)用組），1次/d，自第1天至第15天，并于第10、12、15天記錄腫瘤體積。

1.3 MDSC占外周血單核細(xì)胞比例的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。實(shí)驗(yàn)第10、12和15天鼠尾靜脈采血，肝素抗凝，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后進(jìn)行FITC-CD11b和APC-Gr1流式抗體染色，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 MDSC 中 IFN-酌、IL-12、CXCL-9和 CXCL-2 mR原NA測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于第15天結(jié)束后麻醉處死小鼠，取出脾臟，將脾臟置于兩片滅菌玻片毛面間輕輕摩擦，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選其中的MDSC，加入適量的Trizol液，提取RNA，采用PrimeScript RT Master Mix合成cDNA。采用SYBR Green域Mix試劑盒進(jìn)行定量PCR分析，反應(yīng)體系為15滋l，包括：cDNA 1滋g，上下游引物各 0.5滋l，SYBR Green域Mix 7.5滋l，水補(bǔ)足，檢測(cè)細(xì)胞因子 IFN-酌、IL-12、CX原CL-9和CXCL-2 mRNA水平變化。擴(kuò)增條件：95益預(yù)變性1min，按以下條件擴(kuò)增 40個(gè)循環(huán)：95益 15s，57益1min。引物序列見(jiàn)表1。

表1 IFN-γ、IL-12、CXCL-9和CXCL-2的引物序列

1.5 MDSC中IL-12蛋白表達(dá)水平測(cè)定 采用Western blot法。收集脾臟MDSC細(xì)胞，加入適量的組織裂解液，冰上裂解30min，4益，14 800r/min離心30min，取上清液，經(jīng)蛋白定量后，取30滋g總蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離；經(jīng)電轉(zhuǎn)膜后，用3%牛血清白蛋白室溫封閉90min，加入一抗，4益孵育過(guò)夜；PBST緩沖液洗滌，每次5min，共5次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，PBST緩沖液洗膜，每次5min，共5次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯影，以茁-actin為內(nèi)參。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物聯(lián)用與單獨(dú)應(yīng)用4組小鼠腫瘤體積的比較ZSP1組、DOC組和聯(lián)用組小鼠的腫瘤體積在第10、12、15天比對(duì)照組明顯縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)表 2。

表2 藥物聯(lián)用與單獨(dú)應(yīng)用4組小鼠腫瘤體積的比較（mm3）

2.2 TLR4KO組與WT組小鼠腫瘤體積的比較 TLR4KO組小鼠的腫瘤體積在第10、12天較WT組明顯縮?。ň鵓＜0.01），而在第15天，兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 3。

表3 TLR4KO組與WT組小鼠腫瘤體積的比較（mm3）

2.3 藥物聯(lián)用與單獨(dú)應(yīng)用4組小鼠MDSC占外周血單核細(xì)胞比例的比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，第12、15天聯(lián)用組小鼠的MDSC比例均明顯低于對(duì)照組、ZSP1組和DOC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖1和表4。

圖1 藥物聯(lián)用與單獨(dú)應(yīng)用4組小鼠不同時(shí)間流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.4 TLR4KO 組與 WT 組小鼠 IFN-酌、IL-12、CXCL-9、CXCL-2 mRNA表達(dá)水平和IL-12蛋白表達(dá)水平比較與WT組相比，TLR4KO組IFN-酌、IL-12和CXCL9mRNA表達(dá)水平均明顯增加（均P＜0.01），而CXCL-2mRNA表達(dá)水平未見(jiàn)差異（P＞0.05），見(jiàn)表5。IL-12蛋白表達(dá)水平有所增加，見(jiàn)圖2。

3 討論

以往的研究發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖可以降低荷瘤小鼠脾臟中MDSC占脾臟細(xì)胞的比例，而MDSC是腫瘤微環(huán)境中主要的免疫負(fù)調(diào)控細(xì)胞之一，MDSC減少有助于解除對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)，從而發(fā)揮機(jī)體自身的抗腫瘤免疫作用，促進(jìn)腫瘤體積變小。

表4 藥物聯(lián)用與單獨(dú)應(yīng)用4組小鼠MDSC占外周血單核細(xì)胞比例的比較（%）

表5 TLR4KO組與WT組小鼠IFN-γ、IL-12、CXCL-9和CXCL-2 mRNA表達(dá)水平比較

圖2 TLR4KO組與WT組小鼠IL-12蛋白表達(dá)的電泳圖

DOC作為肺癌臨床治療的二線藥物，常用于一線化療藥抵抗時(shí)的候選用藥。有研究表明，化療起效與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，化療是通過(guò)免疫系統(tǒng)中的CD4+和CD8+T細(xì)胞來(lái)發(fā)揮抗腫瘤療效，且其與非腫瘤細(xì)胞表達(dá)IFN-酌受體有關(guān)[12]。T細(xì)胞分泌IFN-酌，作用于腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）表面的IFN-酌受體后，CAF分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子減少，導(dǎo)致血管新生減少[13-14]，引起腫瘤缺血性壞死。也有學(xué)者認(rèn)為是由于IFN-酌直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞[15]，導(dǎo)致其凋亡，從而阻斷腫瘤內(nèi)的血管新生。

化療可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡（im原munogenic cell death，ICD）[16]。某些化療藥（蒽環(huán)類及鉑類）誘導(dǎo)ICD后，引起機(jī)體產(chǎn)生腫瘤特異性免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤體積縮小，該效應(yīng)與TLR4受體有關(guān)。有研究采用光治療與免疫佐劑糖化殼聚糖聯(lián)用，利用光治療產(chǎn)生的ICD效應(yīng)，通過(guò)免疫佐劑的刺激效應(yīng)，進(jìn)一步激活機(jī)體的腫瘤特異性免疫反應(yīng)，在胰腺癌治療中取得了一定的效果[17]。

本研究將化療藥物與免疫調(diào)節(jié)劑竹蓀多糖聯(lián)用，一方面發(fā)揮了化療藥物的強(qiáng)力殺傷效應(yīng)，另一方面竹蓀多糖對(duì)腫瘤微環(huán)境起改善作用，結(jié)果顯示兩者聯(lián)用后，荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)減慢，體內(nèi)的MDSC比例下調(diào)。這一結(jié)果提示臨床上可以將調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的竹蓀多糖組分ZSP1與DOC聯(lián)合應(yīng)用于肺癌的治療，化療藥物與腫瘤免疫的關(guān)系研究可為臨床肺癌治療方案的制定提供新的思路。