劉永瑞　張妍　李秀英

摘要：目的 ?調(diào)查濟寧市第一人民醫(yī)院肺炎克雷伯菌質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶表型及其對常用抗生素的耐藥性，為臨床用藥提供依據(jù)。方法 ?收集2017年1月～7月濟寧市第一人民醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)肺炎克雷伯菌97株，應(yīng)用頭孢西丁紙片擴散法進行肺炎克雷伯菌AmpC酶表型初篩，對初篩陽性菌用多重PCR方法檢測質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶基因，分析其耐藥情況。結(jié)果 ?97株肺炎克雷伯菌中共篩選出40株對頭孢西丁不敏感菌株，經(jīng)多重PCR擴增，有7株AmpC酶陽性，檢出率為7.22%（7/97），均為DHA型。產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株僅對亞胺培南敏感（100.00%）。結(jié)論 ?濟寧市第一人民醫(yī)院產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶肺炎克雷伯菌發(fā)生率相對較低，以DHA型基因為主，治療應(yīng)首選碳青霉烯類抗菌藥物。

關(guān)鍵詞：肺炎克雷伯菌;質(zhì)粒;AmpC酶;藥敏結(jié)果

中圖分類號：R378.99 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.039

文章編號：1006-1959（2019）19-0122-03

Klebsiella Pneumoniae AmpC Enzyme Detection and Antibiotic Selection

LIU Yong-rui，Zhang Yan，LI Xiu-ying

（Department of Respiratory，the First People's Hospital of Jining，Jining 272100，Shandong，China）

Abstract：Objective ?To investigate the AmpC phenotype of Klebsiella pneumoniae mediated by Klebsiella pneumoniae in Jining First People's Hospital and its resistance to common antibiotics， and provide evidence for clinical use.Methods ?A total of 97 strains of non-repetitive Klebsiella pneumoniae isolated from the First People's Hospital of Jining City from January to July 2017 were collected. The phenycepin diffusion method was used to screen the AmpC enzyme phenotype of Klebsiella pneumoniae. The primary screening positive bacteria were detected by multiplex PCR method for plasmid-mediated AmpC enzyme gene， and the drug resistance was analyzed.Results A total of 40 strains of cefoxitin-insensitive strains were screened from 97 strains of Klebsiella pneumoniae. Seven strains of AmpC enzyme were positive by multiplex PCR， and the detection rate was 7.22% （7/97）， all of which were DHA type. The plasmid-mediated AmpC enzyme strain was only sensitive to imipenem （100.00%）.Conclusion ?The incidence of plasmid-mediated AmpC enzyme Klebsiella pneumoniae in the First People's Hospital of Jining City is relatively low. The DHA type gene is the main treatment. The carbapenem antibiotics should be the first choice for treatment.

Key words：Klebsiella pneumoniae;Plasmid;AmpC enzyme;Drug susceptibility results

根據(jù)中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測顯示，目前我國臨床分離菌株以革蘭氏陰性桿菌為主，其中腸桿菌屬中以大腸桿菌及肺炎克雷伯菌為主[1]。隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素在臨床的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的現(xiàn)象也日益嚴(yán)重。其中細(xì)菌產(chǎn)生各種水解酶是革蘭氏陰性桿菌耐藥的主要機制[2]，目前臨床上研究比較多、且對廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的重要機制是細(xì)菌產(chǎn)生AmpC β-內(nèi)酰胺酶（AmpC酶），AmpC酶是由革蘭氏陰性桿菌的染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的一類β-內(nèi)酰胺酶。革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)AmpC酶菌株呈現(xiàn)廣泛的耐藥。因此及時檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶對指導(dǎo)臨床抗生素的選擇具有一定意義。本研究對我院肺炎克雷伯菌產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶基因型及耐藥性進行研究，旨在為臨床合理應(yīng)用抗生素提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料 ?①菌株來源：收集2017年1月～7月濟寧市第一人民醫(yī)院全院住院患者臨床標(biāo)本中（包括呼吸道、血液、分泌物等）分離的無重復(fù)肺炎克雷伯菌97株。②質(zhì)控菌株：大腸埃希菌 ATCC 25922為陰性質(zhì)控菌株，陰溝腸桿菌 029M為陽性質(zhì)控菌株。

1.2試劑及儀器 ?主要試劑與儀器包括Vitek 2 Compact全自動微生物檢定儀（法國生物梅里埃公司）、PCR擴增儀（美國 Perkin Elmer公司）、頭孢西?。‵OX，30 μg）藥敏紙片（英國Osoid公司）、凝膠電泳儀（上海天能公司）。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定 ?對臨床分離非重復(fù)菌株接種血瓊脂培養(yǎng)基，試驗菌株應(yīng)用全自動微生物檢定儀進行鑒定。

1.3.2產(chǎn)AmpC酶菌株初篩 ?采用K-B紙片擴散法初篩，以FOX（30 μg）藥敏紙片檢測分離菌株，按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑≤18 mm者可疑為產(chǎn)AmpC酶菌株。

1.3.3質(zhì)粒AmpC酶基因檢測 ?應(yīng)用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取初篩試驗陽性菌為PCR模板，操作按說明書進行。用多重PCR引物序列（上海生工合成）[3]，引物序列見表1。反應(yīng)體系50 μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 3 min;94℃變性35 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次;72℃延伸8 min。最后所得PCR產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，通過凝膠電泳儀觀察結(jié)果并拍照記錄。

2結(jié)果

2.1初步篩選結(jié)果 ?97株肺炎克雷伯菌中有40株對頭孢西丁中介或耐藥，為初篩產(chǎn)AmpC酶陽性菌，檢出率為41.24%（40/97）。

2.2多重PCR結(jié)果 ?多重PCR顯示7株肺炎克雷伯菌株擴增陽性條帶（405 bp），判定均為DHA型，檢出率為7.22%（7/97），見圖1。

2.3藥敏結(jié)果 ?產(chǎn)DHA型質(zhì)粒AmpC酶的肺炎克雷伯菌對三、四代頭孢菌素耐藥，僅對亞胺培南較敏感（100.00%），見表2。

3討論

肺炎克雷伯菌是臨床常見的條件致病菌[4]，自從1988年美國發(fā)現(xiàn)第一個質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶，新質(zhì)粒以每年1～2個的數(shù)目被發(fā)現(xiàn)，近幾年質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶相繼被發(fā)現(xiàn)[5]，質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC呈持續(xù)高表達(dá)，且可以通過轉(zhuǎn)化、接合等方式轉(zhuǎn)移給其他細(xì)菌，從而造成耐藥菌株的廣泛產(chǎn)生。質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶在大腸桿菌、克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌及奇異變形桿菌中持續(xù)高表達(dá)，因此產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶肺炎克雷伯菌所致的感染病死率更高[6]，從而增加了臨床抗感染治療的難度，通過檢測肺炎克雷伯菌中AmpC酶在我院的分布以及其藥敏情況，對于指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素提供一定的依據(jù)。

本試驗采用頭孢西丁藥敏紙片法對臨床分離的97株肺炎克雷伯菌進行初篩，其中可疑產(chǎn)AmpC酶菌株40株。對初篩陽性肺炎克雷伯菌采用多重PCR技術(shù)檢測其基因型，結(jié)果顯示7株肺炎克雷伯菌擴增出目的片段大小約405 bp的條帶，根據(jù)片段大小確定為DHA型AmpC酶，產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶肺炎克雷伯菌的總檢出率7.22%，低于張戡等[7]的報道，考慮可能與收集菌株時間范圍較小有關(guān)，下一步可通過研究更多菌株來減少誤差。世界范圍AmpC耐藥基因以CMY型多見，國內(nèi)以DHA-1型和ACT型多見，本研究對產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶肺炎克雷伯菌進行AmpC酶基因檢測，確定均為DHA型，與文獻報道一致[8，9]，結(jié)合本研究結(jié)果推測，DHA型可能是國內(nèi)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的主要基因型。

本研究藥敏結(jié)果顯示，產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌表現(xiàn)為多重耐藥，對頭孢曲松、頭孢他定、頭孢吡肟等三、四代頭孢菌素均耐藥。四代頭孢菌素因能快速通過外膜屏障，一般推薦治療產(chǎn)AmpC酶菌株感染，本試驗中產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌對四代頭孢菌素頭孢吡肟也呈現(xiàn)高度耐藥（71.43%），考慮可能同時合并其他耐藥機制，因此本院對于產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶肺炎克雷伯菌感染應(yīng)避免使用四代頭孢菌素;產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星等喹諾酮及氨基糖甙類抗生素也高度耐藥，提示產(chǎn)酶肺炎克雷伯菌可能存在多種耐藥機制;產(chǎn)酶菌株僅對碳青霉烯類抗生素亞胺培南敏感，因碳青霉烯類抗生素對β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定，與青霉素結(jié)合蛋白親和力強，因此臨床治療產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌感染首選碳青霉烯類抗生素。同時，為了控制耐藥菌的流行，應(yīng)加強AmpC的檢測，以指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗菌藥物。

參考文獻：

[1]胡付品，郭燕，朱德妹，等.2016年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志，2017，17（5）：481-491.

[2]趙虎，孔憲濤.AmpC β內(nèi)酰胺酶的檢測[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2003，26（6）： 390-392.

[3]王新慧，許可欣.產(chǎn)AmpC 酶大腸埃希菌的檢測及耐藥分析[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（8）：1112-1114.

[4]Younas S，Ejaz H，Zafar A，et al.AmpC beta-lactamases in Klebsiella pneumoniae：An emerging threat to the paediatric patients[J].Park Med Assoc，2018，68（6）：893-897.

[5]Markovska R，Schneider I，Marteva-Proevsk Y，et al.First detection of the AmpC beta-lactamase ACC-1 in a Klebsiella pneumoniae isolate in Bulgaria[J].Chemother，2012，24（5）：307-308.

[6]王曉麗，葛亮，李興華.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和頭孢菌素酶肺炎克雷伯菌的分布及耐藥特征分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2018，28（1）：5-9.

[7]張戡，鄧敏，謝新，等.產(chǎn)AmpC肺炎克雷伯菌質(zhì)粒介導(dǎo)的多藥耐藥性與基因型研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（1）：7-9.

[8]Liu XQ，Liu YR.Detection and genotype analysis of AmpC β-lactamase in Klebsiella pneumoniae from tertiary hospitals[J].Exp Ther Med，2016，12（1）：480-484.

[9]鄭港森，劉贊贊，張加勤，等.大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌質(zhì)粒型AmpC酶基因型的檢測分析[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015， 36（11）：1505-1506.