秦 靜 張 堅 段大鵬 張 樂
視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,RB)原發(fā)于視網(wǎng)膜,好發(fā)于兒童,是1種眼內(nèi)的惡性腫瘤,危害性極大[1]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤治療手段雖多,但多數(shù)患者預(yù)后仍差[2-3]。既往研究已證實(shí)Survivin基因與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系,因此本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建重組腺病毒載體Survivin-shRNA并轉(zhuǎn)染至HXO-RB44細(xì)胞后,檢測細(xì)胞增殖活性、凋亡指數(shù)、侵襲性以及PCNA、CAS-3蛋白的表達(dá)水平,從而評估其對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的影響,研討其可能機(jī)制。
視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-RB44細(xì)胞(購自中科院上海細(xì)胞庫)。
胎牛血清、雙抗,美國Gibco公司;CAS-3、PCNA,美國Sigma公司;凋亡試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;流式細(xì)胞儀,美國Becton Dickinson公司;顯微鏡成像系統(tǒng),德國Leica公司。
從液氮中取出先前凍存的活細(xì)胞,置水浴箱中,使其快速融化。吸出細(xì)胞懸液后加入培養(yǎng)液中,離心、吹打后移至含10%~15%胎牛血清、100 μg/ml雙抗的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。80%~90%細(xì)胞貼壁時傳代。
shRNA序列由上海吉凱公司設(shè)計合成,采用腺病毒介導(dǎo),構(gòu)建Survivin-shRNA載體,在6孔板中接種HXO-RB44細(xì)胞,待60%~80%細(xì)胞生長融合時轉(zhuǎn)染。重組Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染HXO-RB44細(xì)胞后以1∶5的比例傳代。按照不同處理方法分為Survivin-shRNA組、GFP組和CON組。
對數(shù)生長期的HXO-RB44細(xì)胞計數(shù)后接種于96孔培養(yǎng)板中,重復(fù)4孔,同時設(shè)對照組。培養(yǎng)24 h后加20 μlMTT,再繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔加150 μl DMSO。在平板震蕩器中震蕩10 min。應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀,于490 nm波長處測定吸光度(OD)值,以空白對照孔OD值調(diào)零。按照公式計算細(xì)胞增殖抑制率:(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。
應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù),檢測HXO-RB44細(xì)胞凋亡率。取對數(shù)期生長的HXO-RB44細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板,細(xì)胞密度約為105/ml。HXO-RB44細(xì)胞用胰酶消化后,1 500 rpm離心5 min。收集細(xì)胞用PBS重新懸浮細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。取100 μl HXO-RB44細(xì)胞懸液,在1 500 rpm離心5 min,然后加入500 μl的1×Binding Buffer、5 μl Annexin V-FITC及10 μl PI,室溫下避光反應(yīng)5~10 min后上流式細(xì)胞儀分析。
將Matrigel膠鋪于培養(yǎng)小室濾膜上,每孔20~30 μl,37 ℃過夜凝膠,在膜的另一面涂上纖維粘連蛋白,約5×105細(xì)胞/ml 200 μl加入小室內(nèi),培養(yǎng)24 h后擦去膜上層細(xì)胞,將膜取下,甲醛室溫固定30 min,蘇木精染色,乙醇逐級脫水,二甲醛透明后,用刀片裁下膜,置于載玻片上,鏡下計數(shù)。
培養(yǎng)的HXO-RB44細(xì)胞同步化后,提取HXO-RB44細(xì)胞蛋白,BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳至溴酚藍(lán)抵達(dá)分離膠底部結(jié)束電泳,入電轉(zhuǎn)緩沖液平衡5 min后轉(zhuǎn)膜。然后抗原抗體反應(yīng),并用辣根過氧化物酶化學(xué)增強(qiáng)劑顯色反應(yīng)。采用GAPDH進(jìn)行標(biāo)化,然后通過軟件進(jìn)行灰度掃描及定量。
應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,多組樣本比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)。
MTT結(jié)果表明,Survivin-shRNA對HXO-RB44細(xì)胞的生長有明顯抑制作用。如圖1所示,在24 h時,CON組的增殖抑制率為(7.69±1.12)%,GFP組的增殖抑制率為(8.06±1.26)%,而Survivin-shRNA組的增殖抑制率為(24.90±4.55)%,差異有顯著性(P<0.05)。在48 h和72 h也有相同的趨勢。另外,在CON組及GFP組中,72 h增殖率與24 h、48 h相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05),而Survivin-shRNA組中,72 h時細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)到(43.92±6.18)%,明顯高于24 h的(24.90±4.55)%和48 h時的(27.35±5.23)%,差異均有顯著性(P<0.05)。
圖1 各組HXO-RB44細(xì)胞增殖抑制率
流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),與Control組和GFP組相比,Survivin-shRNA組HXO-RB44細(xì)胞早期凋亡率增高,差異有顯著性(P<0.05),見圖2。
圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HXO-RB44細(xì)胞凋亡率
transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比較,Survivin-shRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05),提示Survivin-shRNA能抑制HXO-RB44細(xì)胞的侵襲能力(圖3)。
圖3 各組HXO-RB44細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)比較
Westtern blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),Survivin-shRNA可降低PCNA蛋白的表達(dá)水平,并提高CAS-3的表達(dá)水平,見圖4。
圖4 各組HXO-RB44細(xì)胞蛋白表達(dá)水平
視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤在全世界發(fā)病率約為1∶20 000[4],其發(fā)病率有逐年上升的趨勢[5],最早由Pawius報道。目前趨向于個性化綜合治療包括手術(shù)摘除眼球、化學(xué)減容法、外照射、激光、溫?zé)岑煼?、冷凍療法及針對轉(zhuǎn)移腫瘤的全身化療等[6-7]。隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步,患者的生存率得到了極大地提高,但總體生存率仍低于50%[8-9]。
既往研究表明,Survivin在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的特異表達(dá),并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),國內(nèi)外許多學(xué)者對Survivin基因與惡性腫瘤關(guān)系進(jìn)行了深入研究,因此Survivin靶向治療有可能會是1種有效的嘗試[10]?;蛑委熤?,RNA干擾技術(shù)是其中的1種常用的方法靶向Survivin的基因干擾可阻斷Survivin表達(dá),從而抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移[11]。靶向基因治療具有特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),一般不產(chǎn)生嚴(yán)重反應(yīng)。
本研究結(jié)果顯示,Survivin-shRNA可明顯抑制HXO-RB44細(xì)胞的增殖,并且具有時間依賴性。Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),Survivin-shRNA組細(xì)胞凋亡率較Control組和GFP組明顯減少。transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,Survivin-shRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少。以上表明,Survivin-shRNA可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并抑制細(xì)胞的侵襲性生物學(xué)行為。
研究表明,細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),當(dāng)細(xì)胞增殖增加或凋亡減少,則易致腫瘤發(fā)生發(fā)展。Caspase家族是研究細(xì)胞凋亡最常見的細(xì)胞因子,是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者,決定了細(xì)胞凋亡的形態(tài)和生物化學(xué)改變[12]。當(dāng)caspase受到抑制,使細(xì)胞凋亡障礙,就可能引起多種腫瘤的發(fā)生[13]。PCNA是DNA復(fù)制所必需的,并已被證明是腫瘤增殖1個重要的標(biāo)記,Survivin的表達(dá)已被證實(shí)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中PCNA和CAS-3密切相關(guān)[14-15]。我們的研究發(fā)現(xiàn),敲除視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞Survivin,可以下調(diào)PCNA的表達(dá),上調(diào)CAS-3的表達(dá),提示Survivin可能通過調(diào)節(jié)PCNA和CAS-3的表達(dá)參與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖和凋亡。
Survivin-shRNA抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并抑制其侵襲能力,其機(jī)制可能是通過調(diào)控PCNA、CAS-3蛋白的表達(dá),激活相關(guān)細(xì)胞凋亡信號通路來完成。