秦 靜 張 堅(jiān) 段大鵬 張 樂

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)原發(fā)于視網(wǎng)膜，好發(fā)于兒童，是1種眼內(nèi)的惡性腫瘤，危害性極大[1]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤治療手段雖多，但多數(shù)患者預(yù)后仍差[2-3]。既往研究已證實(shí)Survivin基因與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，因此本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建重組腺病毒載體Survivin-shRNA并轉(zhuǎn)染至HXO-RB44細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞增殖活性、凋亡指數(shù)、侵襲性以及PCNA、CAS-3蛋白的表達(dá)水平，從而評(píng)估其對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的影響，研討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-RB44細(xì)胞(購自中科院上海細(xì)胞庫)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

胎牛血清、雙抗，美國Gibco公司；CAS-3、PCNA，美國Sigma公司；凋亡試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；流式細(xì)胞儀，美國Becton Dickinson公司；顯微鏡成像系統(tǒng)，德國Leica公司。

1.3 HXO-RB44細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中取出先前凍存的活細(xì)胞，置水浴箱中，使其快速融化。吸出細(xì)胞懸液后加入培養(yǎng)液中，離心、吹打后移至含10%～15%胎牛血清、100 μg/ml雙抗的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。80%～90%細(xì)胞貼壁時(shí)傳代。

1.4 Survivin-shRNA構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

shRNA序列由上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)合成，采用腺病毒介導(dǎo)，構(gòu)建Survivin-shRNA載體，在6孔板中接種HXO-RB44細(xì)胞，待60%～80%細(xì)胞生長(zhǎng)融合時(shí)轉(zhuǎn)染。重組Survivin-shRNA轉(zhuǎn)染HXO-RB44細(xì)胞后以1∶5的比例傳代。按照不同處理方法分為Survivin-shRNA組、GFP組和CON組。

1.5 HXO-RB44細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HXO-RB44細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于96孔培養(yǎng)板中，重復(fù)4孔，同時(shí)設(shè)對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后加20 μlMTT，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加150 μl DMSO。在平板震蕩器中震蕩10 min。應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值，以空白對(duì)照孔OD值調(diào)零。按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)HXO-RB44細(xì)胞凋亡率。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HXO-RB44細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞密度約為105/ml。HXO-RB44細(xì)胞用胰酶消化后，1 500 rpm離心5 min。收集細(xì)胞用PBS重新懸浮細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。取100 μl HXO-RB44細(xì)胞懸液，在1 500 rpm離心5 min，然后加入500 μl的1×Binding Buffer、5 μl Annexin V-FITC及10 μl PI，室溫下避光反應(yīng)5～10 min后上流式細(xì)胞儀分析。

1.7 Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)測(cè)細(xì)胞侵襲力

將Matrigel膠鋪于培養(yǎng)小室濾膜上，每孔20～30 μl,37 ℃過夜凝膠，在膜的另一面涂上纖維粘連蛋白，約5×105細(xì)胞/ml 200 μl加入小室內(nèi)，培養(yǎng)24 h后擦去膜上層細(xì)胞，將膜取下，甲醛室溫固定30 min，蘇木精染色，乙醇逐級(jí)脫水，二甲醛透明后，用刀片裁下膜，置于載玻片上，鏡下計(jì)數(shù)。

1.8 Western blot檢測(cè)HXO-RB44細(xì)胞PCNA、CAS-3蛋白表達(dá)

培養(yǎng)的HXO-RB44細(xì)胞同步化后，提取HXO-RB44細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳至溴酚藍(lán)抵達(dá)分離膠底部結(jié)束電泳，入電轉(zhuǎn)緩沖液平衡5 min后轉(zhuǎn)膜。然后抗原抗體反應(yīng)，并用辣根過氧化物酶化學(xué)增強(qiáng)劑顯色反應(yīng)。采用GAPDH進(jìn)行標(biāo)化，然后通過軟件進(jìn)行灰度掃描及定量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，多組樣本比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Survivin-shRNA對(duì)HXO-RB44細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果表明，Survivin-shRNA對(duì)HXO-RB44細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。如圖1所示，在24 h時(shí)，CON組的增殖抑制率為(7.69±1.12)%，GFP組的增殖抑制率為(8.06±1.26)%，而Survivin-shRNA組的增殖抑制率為(24.90±4.55)%，差異有顯著性(P<0.05)。在48 h和72 h也有相同的趨勢(shì)。另外，在CON組及GFP組中，72 h增殖率與24 h、48 h相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，而Survivin-shRNA組中，72 h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)到(43.92±6.18)%，明顯高于24 h的(24.90±4.55)%和48 h時(shí)的(27.35±5.23)%，差異均有顯著性(P<0.05)。

圖1 各組HXO-RB44細(xì)胞增殖抑制率

2.2 Survivin-shRNA對(duì)HXO-RB44細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Control組和GFP組相比，Survivin-shRNA組HXO-RB44細(xì)胞早期凋亡率增高，差異有顯著性(P<0.05)，見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HXO-RB44細(xì)胞凋亡率

2.3 Survivin-shRNA對(duì)HXO-RB44細(xì)胞侵襲性的影響

transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，Survivin-shRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，提示Survivin-shRNA能抑制HXO-RB44細(xì)胞的侵襲能力(圖3)。

圖3 各組HXO-RB44細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)比較

2.4 Survivin-shRNA對(duì)HXO-RB44細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

Westtern blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Survivin-shRNA可降低PCNA蛋白的表達(dá)水平，并提高CAS-3的表達(dá)水平，見圖4。

圖4 各組HXO-RB44細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

3 討論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤在全世界發(fā)病率約為1∶20 000[4]，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)[5]，最早由Pawius報(bào)道。目前趨向于個(gè)性化綜合治療包括手術(shù)摘除眼球、化學(xué)減容法、外照射、激光、溫?zé)岑煼?、冷凍療法及針?duì)轉(zhuǎn)移腫瘤的全身化療等[6-7]。隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，患者的生存率得到了極大地提高，但總體生存率仍低于50%[8-9]。

既往研究表明，Survivin在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的特異表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，國內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)Survivin基因與惡性腫瘤關(guān)系進(jìn)行了深入研究，因此Survivin靶向治療有可能會(huì)是1種有效的嘗試[10]?；蛑委熤校琑NA干擾技術(shù)是其中的1種常用的方法靶向Survivin的基因干擾可阻斷Survivin表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移[11]。靶向基因治療具有特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，一般不產(chǎn)生嚴(yán)重反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，Survivin-shRNA可明顯抑制HXO-RB44細(xì)胞的增殖，并且具有時(shí)間依賴性。Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Survivin-shRNA組細(xì)胞凋亡率較Control組和GFP組明顯減少。transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Survivin-shRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少。以上表明，Survivin-shRNA可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞的侵襲性生物學(xué)行為。

研究表明，細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞增殖增加或凋亡減少，則易致腫瘤發(fā)生發(fā)展。Caspase家族是研究細(xì)胞凋亡最常見的細(xì)胞因子，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，決定了細(xì)胞凋亡的形態(tài)和生物化學(xué)改變[12]。當(dāng)caspase受到抑制，使細(xì)胞凋亡障礙，就可能引起多種腫瘤的發(fā)生[13]。PCNA是DNA復(fù)制所必需的，并已被證明是腫瘤增殖1個(gè)重要的標(biāo)記，Survivin的表達(dá)已被證實(shí)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中PCNA和CAS-3密切相關(guān)[14-15]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，敲除視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞Survivin，可以下調(diào)PCNA的表達(dá)，上調(diào)CAS-3的表達(dá)，提示Survivin可能通過調(diào)節(jié)PCNA和CAS-3的表達(dá)參與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤增殖和凋亡。

Survivin-shRNA抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制其侵襲能力，其機(jī)制可能是通過調(diào)控PCNA、CAS-3蛋白的表達(dá)，激活相關(guān)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路來完成。