羅璇，王秀原，錢靜，羅紫薇

(武漢設(shè)計工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院,武漢 430205)

生姜蛋白酶是從生姜中提取出的一種新型植物蛋白酶[1]，其應(yīng)用前景十分廣泛，可用作食品添加劑，如嫩肉劑、酒澄清劑、乳制品凝固劑等[2]，且具有極好的藥用保健價值；但在實際生產(chǎn)應(yīng)用中，處于游離狀態(tài)的生姜蛋白酶對于環(huán)境較敏感，易失活，反應(yīng)后難以回收[3]，導(dǎo)致其無法重復(fù)利用。

傳統(tǒng)酶的固定化多采用明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維素和聚丙烯酰胺等為載體[4]，而以納米Fe3O4為主的磁性固定化材料具有良好的磁響應(yīng)性和生物相容性的顯著特征，且其酶結(jié)合能力較高[5]，毒性小，易回收。磁性Fe3O4納米粒子可以和各種天然生物大分子、合成高分子及無機物反應(yīng)生成磁性復(fù)合微球，避免其由于磁性吸引和分子間作用力發(fā)生聚集沉淀，又可以在表面引入活性功能基團，被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域[6]。

目前，國內(nèi)外對于生姜蛋白酶磁性復(fù)合載體的固定化研究還未見報道?，F(xiàn)有的利用磁性復(fù)合體對酶的固定化研究報道也不多，且少量研究集中于磁性復(fù)合載體對脂肪酶、纖維素酶及果膠酶的固定化[7-9]。

為了進一步提高在實際操作過程中固定化生姜蛋白酶的穩(wěn)定性及回收率，本研究采用海藻酸鈉、明膠與Fe3O4磁核制備成磁性復(fù)合載體，并結(jié)合戊二醛交聯(lián)，協(xié)同對生姜蛋白酶進行固定，以得到磁性復(fù)合載體固定化生姜蛋白酶；并通過單因素試驗結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面分析法進行優(yōu)化，確定固定生姜蛋白酶最佳工藝條件及預(yù)測模型，并對固定化酶與游離酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進行研究，旨在為磁性復(fù)合載體對生姜蛋白酶的固定化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮生姜：市售；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、氨水、海藻酸鈉、明膠、三氯化鐵、硫酸亞鐵、三氯乙酸、碳酸鈉、干酪素、50%戊二醛、氯化鈣、氯化鈉：均為分析純；福林酚試劑：生物純。

UV2000紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；TG16-WS離心機 長沙湘智離心機儀器公司；FA 2014 B電子天平 上海越平科技儀器有限公司；HH-S2電熱恒溫水浴鍋、SHZ-88恒溫振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 生姜蛋白酶液的制備

取外形完好、無腐爛和機械損傷的新鮮生姜50 g，洗凈, 切成小塊后，加入2倍體積的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 6)研磨30 min，過濾, 將濾液收集至250 mL的三角瓶中，并置于4 ℃冰箱中，2 h后以4000 r/min離心10 min，取上清液，即得生姜蛋白酶液，測其初始酶活。

1.2.2 Fe3O4磁核制備

將0.25 mol/L的硫酸亞鐵溶液100 mL、0.5 mol/L氯化鐵溶液200 mL以及0.1 mol/L檸檬酸鈉溶液40 mL混合，于75 ℃恒溫攪拌10 min，滴加10%氨水調(diào)節(jié)pH為10，并等待其繼續(xù)反應(yīng)40 min后，離心10 min，棄上清液，濾渣用蒸餾水重復(fù)洗滌至中性，放入80 ℃烘箱干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 磁性海藻酸鈉明膠微球的制備方法

將一定量的Fe3O4磁核與3.5%海藻酸鈉及3.0%明膠以一定體積比例混合，室溫下恒溫振蕩器混合均勻；用注射器吸取上述混合液，從一定高度滴入濃度為2% 的CaCl2溶液中，以形成凝膠微球；更換CaCl2溶液，于4 ℃下靜置硬化2 h后，再濾出凝膠微球，用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的NaCl溶液洗滌，瀝干，于 50 ℃干燥。

1.2.4 固定化生姜蛋白酶

將磁性凝膠微球與戊二醛交聯(lián)2.5 h后，用蒸餾水洗滌，并于50 ℃干燥，以獲得磁性凝膠微球復(fù)合載體。將其與酶液混合，室溫下恒溫振蕩器混合均勻，用蒸餾水洗滌，獲得磁性復(fù)合載體固定化生姜蛋白酶，并測其酶活。

1.2.5 生姜蛋白酶活力的測定[10]

酶活力測定方法：分別取酶液和酪蛋白底物1 mL于水浴中預(yù)熱 2 min，混合均勻后繼續(xù)恒溫反應(yīng)10 min，加入 0.4 mol/L 三氯乙酸 2 mL，沉淀殘余蛋白。離心，取1 mL上清液，加入 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液和 1 mL稀釋后的福林酚試劑，混合均勻，在 40 ℃水浴顯色 10 min，用紫外可見分光光度計測試其在 680 nm下的吸光度。

生姜蛋白酶活力(U)=A×K×N×4/10。

式中：A為樣品的平均吸光度值；K為100除以酪氨酸標準曲線上100 μg/mL對應(yīng)680 nm處的吸光度值；N為酶液稀釋倍數(shù)；4為反應(yīng)液總體積；10為10 min，酶液分解酪蛋白反應(yīng)時間。

固定化酶相對酶活力(%)=每次使用后固定化酶活力/最高固定化酶活力×100。

1.2.6 酪氨酸標準曲線的制作方法

分別取0，10，20，30，40，50 μg/mL濃度的酪氨酸標準溶液0，1，2，3，4，5 mL于試管中，并分別用蒸餾水定容至10 mL, 再于每個試管中滴加0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.0 mL和福林試劑使用液1.0 mL，置于40 ℃水浴中恒溫反應(yīng)20 min；在波長680 nm下, 以O(shè)D值為橫坐標，酪氨酸標準溶液的濃度為縱坐標，繪制酪氨酸標準曲線；根據(jù)空白對照,測定不同酪氨酸濃度的溶液吸光度。

1.2.7 主要影響因素的確定

根據(jù)文獻[9]設(shè)計表1中的單因素試驗水平條件，測定其對應(yīng)的酶活力，并換算成相對酶活力。

表1 溶劑提取單因素試驗因素水平

1.2.8 響應(yīng)面設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對酶活影響最大的因素即海藻酸鈉濃度、戊二醛濃度、Fe3O4磁核量為主要影響因素，結(jié)合Box-Behnken法，設(shè)計試驗方案，并對所得數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面分析，中心試驗重復(fù)3次。響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

1.2.9.1 單因素試驗結(jié)果的數(shù)據(jù)處理

借助SPSS V18.0來處理單因素的試驗數(shù)據(jù)，確定影響固定化生姜蛋白酶活力的各因素的大小關(guān)系，根據(jù)單因素試驗的方差分析表，選出顯著性最大的3個因素。

1.2.9.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果的數(shù)據(jù)處理

結(jié)合Box-Behnken對試驗結(jié)果進行分析處理，可得出響應(yīng)面方案表，二次回歸模型，回歸方程的方差分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線

圖1 酪氨酸標準曲線

由圖1可知，酪氨酸標準曲線R2=0.9995，說明線性關(guān)系很好。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

按照1.2.5的實驗方法，分別測出在不同F(xiàn)e2+∶Fe3+體積比、海藻酸鈉與明膠體積比、固定化pH、戊二醛濃度、Fe3O4磁核量、固定時間、酶量、交聯(lián)時間8個因素不同指標下OD680的吸光值，并將各因素條件下最高酶活力作為100%，換算為生姜蛋白酶的相對酶活力。

2.2.1 不同F(xiàn)e2+∶Fe3+體積比對固定化酶制備的影響

圖2 不同F(xiàn)e2+∶Fe3+體積比對固定化酶制備的影響

由圖2可知，當(dāng)Fe2+∶Fe3+的體積比為0.75∶1時，所制備的固定化酶相對酶活力較高；之后隨Fe2+的濃度升高，相對酶活力逐漸減小。

2.2.2 海藻酸鈉與明膠體積比對固定化酶制備的影響

表3 不同體積比的海藻酸鈉與明膠對固定化酶的影響

由表3可知，海藻酸鈉與明膠體積比對形成的微球有重要影響，當(dāng)兩者體積比低于2.0∶1.0時，用注射器制作的海藻酸鈉凝膠會形成明顯的拖尾現(xiàn)象，海藻酸鈉凝膠微球不成形，洗滌時酶易被沖洗掉，使測得的酶活力降低，由圖3可知，海藻酸鈉與明膠體積比在2.0∶1.0時相對酶活力最高，當(dāng)兩者體積比高于2.0∶1.0時，用注射器制作凝膠微球很困難，經(jīng)固定化后的酶不易釋放酶活。

圖3 海藻酸鈉濃度對酶活力的影響

2.2.3 戊二醛濃度對酶活力的影響

圖4 戊二醛濃度對酶活力的影響

由圖4可知，戊二醛的濃度為3%時，固定化酶的相對酶活力達到最高值。

2.2.4 交聯(lián)時間對酶活力的影響

圖5 交聯(lián)時間對酶活力的影響

由圖5可知，交聯(lián)時間為1.5 h時，相對酶活力最高。

2.2.5 固定時間對酶活力的影響

圖6 固定時間對酶活力的影響

由圖6可知，固定時間為60 min時，相對酶活力最高。

2.2.6 pH對酶活力的影響

圖7 pH對酶活力的影響

由圖7可知，當(dāng)固定化體系pH 4.4時，固定化生姜蛋白酶相對酶活力最高。分析認為酶蛋白質(zhì)中的-NH2與戊二醛的醛基之間的加成反應(yīng)，需要在酸性環(huán)境中進行。

2.2.7 Fe3O4磁核量對酶活力的影響

圖8 Fe3O4磁核量對酶活力的影響

由圖8可知，當(dāng)Fe3O4磁核量為3.0 mg/mL時，固定化酶相對酶活力最高。

2.2.8 酶量對酶活力的影響

圖9 酶量對酶活力的影響

由圖9可知，1 g微球載體固定30 mg酶量時，相對酶活力最高。1 g微球載體固定的酶量<30 mg時，隨酶量的增加，固定化酶相對酶活力逐步上升；酶量超過30 mg時，固定化酶相對酶活力隨其增加呈下降趨勢。

2.2.9 單因素試驗方差分析表

表4 單因素試驗的方差分析

由表4可知，借助SPSS處理單因素的試驗數(shù)據(jù)，得出固定化生姜蛋白酶活力的影響因素大小關(guān)系為戊二醛濃度>Fe3O4磁核量>海藻酸鈉和明膠體積比>Fe2+∶Fe3+體積比>固定時間>交聯(lián)時間>酶量>pH。其中海藻酸鈉濃度、戊二醛濃度、Fe3O4磁核量3個因素的P值是影響固定化生姜蛋白酶的主要因素，F(xiàn)e2+∶Fe3+體積比影響不顯著，酶量、固定時間、交聯(lián)時間和pH影響的顯著性比海藻酸鈉濃度、戊二醛濃度、Fe3O4磁核量弱。下面應(yīng)用響應(yīng)面進行最優(yōu)分析時，設(shè)定Fe2+∶Fe3+體積比為0.75∶1，交聯(lián)時間為1.5 h，固定時間為60 min，pH值為4.4，酶量為30 mg/g進行工藝優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

用Design-Expert軟件對試驗結(jié)果進行擬合，以固定化生姜蛋白酶酶活力Y為響應(yīng)值，對自變量海藻酸鈉濃度、戊二醛濃度、Fe3O4磁核量3個因素的回歸方程為：

Y=50.2-0.12A+1.51B+1.11C+0.44AB-1.44AC-1.80A2-2.66B2-1.09C2。

表6 回歸方程的方差分析

注：P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

由表6可知，模型P值<0.05，說明該模型顯著；失擬項P值>0.05，說明該回歸擬合的情況良好，可以用其進行固定化酶活力的預(yù)測和分析。對于回歸方程各項的方差分析結(jié)果表明，方程的一次項B，C及二次項A2、B2和C2的P值均小于0.05，顯著；而交互項AB、AC、BC不顯著，說明此方程的擬合較充分。故各因素對固定化酶活力的影響依次為：戊二醛濃度>Fe3O4磁核量>海藻酸鈉濃度，與SPSS分析結(jié)果一致。

去除不顯著的交互項AB、AC、BC，對表6進行二次多元回歸擬合,得到固定化酶活力對3個因素的二次多項回歸方程：

Y=50.2-0.12A+1.51B+1.11C+0.44AB-1.44AC-1.80A2-2.66B2-1.09C2。

經(jīng)優(yōu)化后，模型極顯著，失擬項不顯著，決定系數(shù)R2為0.9929，調(diào)整系數(shù)RAdj2為0.9892，預(yù)測系數(shù)RPred2為0.9699，說明測定值與模型預(yù)測值之間具有良好的相關(guān)度[11]。調(diào)整系數(shù)和預(yù)測系數(shù)值高且接近(RAdj2-RPred2<0.2)，則回歸模型能充分說明工藝過程。

2.4 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖形分析可以直觀地反映出各因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響[12]，3個因素各交互作用影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖10～圖15，響應(yīng)面圖是三維空間立體圖，各試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，各因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響與響應(yīng)面的陡峭程度成正比，即交互作用對響應(yīng)值影響越強，曲面越陡峭，反之則平緩[13],其曲面的最高區(qū)域存在最大值[14]，即實驗結(jié)果y在試驗區(qū)域內(nèi)具有最大極值。通過回歸模型預(yù)測，給出固定化生姜蛋白酶的最佳工藝條件為Fe2+∶Fe3+體積比為0.75∶1、磁核量Fe3O4為3.0 mg/mL，海藻酸鈉與明膠體積比為2∶1，戊二醛濃度為3%，交聯(lián)時間為1.5 h，固定時間為60 min，pH值為4.4，酶量為30 mg/g，在此條件下酶活力的預(yù)測值為50.39 U/g。

圖10 海藻酸鈉濃度和Fe3O4磁核量交互作用的響應(yīng)面圖

圖11 海藻酸鈉濃度和Fe3O4磁核量交互作用的等高線圖

圖12 海藻酸鈉濃度和戊二醛濃度交互作用的響應(yīng)面圖

圖13 海藻酸鈉濃度和戊二醛濃度交互作用的等高線圖

圖14 Fe3O4磁核量和戊二醛濃度交互作用的響應(yīng)面圖

圖15 Fe3O4磁核量和戊二醛濃度交互作用的等高線圖

2.5 最佳固定條件的驗證

單因素試驗結(jié)果與響應(yīng)面試驗結(jié)果相結(jié)合，并通過響應(yīng)面軟件分析得出回歸模型預(yù)測數(shù)值，得出固定化生姜蛋白酶的最佳工藝條件：Fe2+∶Fe3+體積比為0.75∶1，磁核量Fe3O4為3.0 mg/mL，海藻酸鈉與明膠體積比為2∶1，戊二醛濃度為3%，交聯(lián)時間為1.5 h，固定時間為60 min，pH值為4.4，酶量為30 mg/g，在此條件下酶活力的預(yù)測值為50.39 U/g。并以此條件進行3 次平行驗證實驗，固定化生姜蛋白酶的酶活力均值為52.63 U/g，誤差值很小，與預(yù)測值接近，證明了此模型的合理性。

3 結(jié)論

通過單因素試驗結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面分析法進行優(yōu)化后，得到的磁性復(fù)合載體固定生姜蛋白酶的最佳工藝條件為：Fe2+∶Fe3+體積比為0.75∶1、磁核量Fe3O4為3.0 mg/mL、海藻酸鈉與明膠體積比為2∶1、戊二醛濃度3%、交聯(lián)時間1.5 h、固定時間60 min，pH值4.4、酶量30 mg/g。在此條件下，得到固定化生姜蛋白酶的酶活力為52.63 U/g，高于傳統(tǒng)固定制備法所得到的固定化酶酶活，且具有比游離酶良好的穩(wěn)定性。由此可見，磁性載體固定生姜蛋白酶是一種高效可行的固定化方法。