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        磁性復合載體固定生姜蛋白酶的工藝優(yōu)化研究

        2019-11-15 00:45:10羅璇王秀原錢靜羅紫薇
        中國調(diào)味品 2019年11期
        關(guān)鍵詞:戊二醛海藻生姜

        羅璇,王秀原,錢靜,羅紫薇

        (武漢設(shè)計工程學院 食品與生物科技學院,武漢 430205)

        生姜蛋白酶是從生姜中提取出的一種新型植物蛋白酶[1],其應用前景十分廣泛,可用作食品添加劑,如嫩肉劑、酒澄清劑、乳制品凝固劑等[2],且具有極好的藥用保健價值;但在實際生產(chǎn)應用中,處于游離狀態(tài)的生姜蛋白酶對于環(huán)境較敏感,易失活,反應后難以回收[3],導致其無法重復利用。

        傳統(tǒng)酶的固定化多采用明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維素和聚丙烯酰胺等為載體[4],而以納米Fe3O4為主的磁性固定化材料具有良好的磁響應性和生物相容性的顯著特征,且其酶結(jié)合能力較高[5],毒性小,易回收。磁性Fe3O4納米粒子可以和各種天然生物大分子、合成高分子及無機物反應生成磁性復合微球,避免其由于磁性吸引和分子間作用力發(fā)生聚集沉淀,又可以在表面引入活性功能基團,被廣泛應用于生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域[6]。

        目前,國內(nèi)外對于生姜蛋白酶磁性復合載體的固定化研究還未見報道。現(xiàn)有的利用磁性復合體對酶的固定化研究報道也不多,且少量研究集中于磁性復合載體對脂肪酶、纖維素酶及果膠酶的固定化[7-9]。

        為了進一步提高在實際操作過程中固定化生姜蛋白酶的穩(wěn)定性及回收率,本研究采用海藻酸鈉、明膠與Fe3O4磁核制備成磁性復合載體,并結(jié)合戊二醛交聯(lián),協(xié)同對生姜蛋白酶進行固定,以得到磁性復合載體固定化生姜蛋白酶;并通過單因素試驗結(jié)合Box-Behnken響應面分析法進行優(yōu)化,確定固定生姜蛋白酶最佳工藝條件及預測模型,并對固定化酶與游離酶的部分酶學性質(zhì)進行研究,旨在為磁性復合載體對生姜蛋白酶的固定化提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        鮮生姜:市售;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、氨水、海藻酸鈉、明膠、三氯化鐵、硫酸亞鐵、三氯乙酸、碳酸鈉、干酪素、50%戊二醛、氯化鈣、氯化鈉:均為分析純;福林酚試劑:生物純。

        UV2000紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TG16-WS離心機 長沙湘智離心機儀器公司;FA 2014 B電子天平 上海越平科技儀器有限公司;HH-S2電熱恒溫水浴鍋、SHZ-88恒溫振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠。

        1.2 方法

        1.2.1 生姜蛋白酶液的制備

        取外形完好、無腐爛和機械損傷的新鮮生姜50 g,洗凈, 切成小塊后,加入2倍體積的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(0.05 mol/L,pH 6)研磨30 min,過濾, 將濾液收集至250 mL的三角瓶中,并置于4 ℃冰箱中,2 h后以4000 r/min離心10 min,取上清液,即得生姜蛋白酶液,測其初始酶活。

        1.2.2 Fe3O4磁核制備

        將0.25 mol/L的硫酸亞鐵溶液100 mL、0.5 mol/L氯化鐵溶液200 mL以及0.1 mol/L檸檬酸鈉溶液40 mL混合,于75 ℃恒溫攪拌10 min,滴加10%氨水調(diào)節(jié)pH為10,并等待其繼續(xù)反應40 min后,離心10 min,棄上清液,濾渣用蒸餾水重復洗滌至中性,放入80 ℃烘箱干燥,保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 磁性海藻酸鈉明膠微球的制備方法

        將一定量的Fe3O4磁核與3.5%海藻酸鈉及3.0%明膠以一定體積比例混合,室溫下恒溫振蕩器混合均勻;用注射器吸取上述混合液,從一定高度滴入濃度為2% 的CaCl2溶液中,以形成凝膠微球;更換CaCl2溶液,于4 ℃下靜置硬化2 h后,再濾出凝膠微球,用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的NaCl溶液洗滌,瀝干,于 50 ℃干燥。

        1.2.4 固定化生姜蛋白酶

        將磁性凝膠微球與戊二醛交聯(lián)2.5 h后,用蒸餾水洗滌,并于50 ℃干燥,以獲得磁性凝膠微球復合載體。將其與酶液混合,室溫下恒溫振蕩器混合均勻,用蒸餾水洗滌,獲得磁性復合載體固定化生姜蛋白酶,并測其酶活。

        1.2.5 生姜蛋白酶活力的測定[10]

        酶活力測定方法:分別取酶液和酪蛋白底物1 mL于水浴中預熱 2 min,混合均勻后繼續(xù)恒溫反應10 min,加入 0.4 mol/L 三氯乙酸 2 mL,沉淀殘余蛋白。離心,取1 mL上清液,加入 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液和 1 mL稀釋后的福林酚試劑,混合均勻,在 40 ℃水浴顯色 10 min,用紫外可見分光光度計測試其在 680 nm下的吸光度。

        生姜蛋白酶活力(U)=A×K×N×4/10。

        式中:A為樣品的平均吸光度值;K為100除以酪氨酸標準曲線上100 μg/mL對應680 nm處的吸光度值;N為酶液稀釋倍數(shù);4為反應液總體積;10為10 min,酶液分解酪蛋白反應時間。

        固定化酶相對酶活力(%)=每次使用后固定化酶活力/最高固定化酶活力×100。

        1.2.6 酪氨酸標準曲線的制作方法

        分別取0,10,20,30,40,50 μg/mL濃度的酪氨酸標準溶液0,1,2,3,4,5 mL于試管中,并分別用蒸餾水定容至10 mL, 再于每個試管中滴加0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.0 mL和福林試劑使用液1.0 mL,置于40 ℃水浴中恒溫反應20 min;在波長680 nm下, 以O(shè)D值為橫坐標,酪氨酸標準溶液的濃度為縱坐標,繪制酪氨酸標準曲線;根據(jù)空白對照,測定不同酪氨酸濃度的溶液吸光度。

        1.2.7 主要影響因素的確定

        根據(jù)文獻[9]設(shè)計表1中的單因素試驗水平條件,測定其對應的酶活力,并換算成相對酶活力。

        表1 溶劑提取單因素試驗因素水平

        1.2.8 響應面設(shè)計

        在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取對酶活影響最大的因素即海藻酸鈉濃度、戊二醛濃度、Fe3O4磁核量為主要影響因素,結(jié)合Box-Behnken法,設(shè)計試驗方案,并對所得數(shù)據(jù)進行響應面分析,中心試驗重復3次。響應面試驗因素與水平設(shè)計見表2。

        表2 響應面試驗因素與水平

        1.2.9 數(shù)據(jù)處理

        1.2.9.1 單因素試驗結(jié)果的數(shù)據(jù)處理

        借助SPSS V18.0來處理單因素的試驗數(shù)據(jù),確定影響固定化生姜蛋白酶活力的各因素的大小關(guān)系,根據(jù)單因素試驗的方差分析表,選出顯著性最大的3個因素。

        1.2.9.2 響應面試驗結(jié)果的數(shù)據(jù)處理

        結(jié)合Box-Behnken對試驗結(jié)果進行分析處理,可得出響應面方案表,二次回歸模型,回歸方程的方差分析結(jié)果。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 酪氨酸標準曲線

        圖1 酪氨酸標準曲線

        由圖1可知,酪氨酸標準曲線R2=0.9995,說明線性關(guān)系很好。

        2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

        按照1.2.5的實驗方法,分別測出在不同F(xiàn)e2+∶Fe3+體積比、海藻酸鈉與明膠體積比、固定化pH、戊二醛濃度、Fe3O4磁核量、固定時間、酶量、交聯(lián)時間8個因素不同指標下OD680的吸光值,并將各因素條件下最高酶活力作為100%,換算為生姜蛋白酶的相對酶活力。

        2.2.1 不同F(xiàn)e2+∶Fe3+體積比對固定化酶制備的影響

        圖2 不同F(xiàn)e2+∶Fe3+體積比對固定化酶制備的影響

        由圖2可知,當Fe2+∶Fe3+的體積比為0.75∶1時,所制備的固定化酶相對酶活力較高;之后隨Fe2+的濃度升高,相對酶活力逐漸減小。

        2.2.2 海藻酸鈉與明膠體積比對固定化酶制備的影響

        表3 不同體積比的海藻酸鈉與明膠對固定化酶的影響

        由表3可知,海藻酸鈉與明膠體積比對形成的微球有重要影響,當兩者體積比低于2.0∶1.0時,用注射器制作的海藻酸鈉凝膠會形成明顯的拖尾現(xiàn)象,海藻酸鈉凝膠微球不成形,洗滌時酶易被沖洗掉,使測得的酶活力降低,由圖3可知,海藻酸鈉與明膠體積比在2.0∶1.0時相對酶活力最高,當兩者體積比高于2.0∶1.0時,用注射器制作凝膠微球很困難,經(jīng)固定化后的酶不易釋放酶活。

        圖3 海藻酸鈉濃度對酶活力的影響

        2.2.3 戊二醛濃度對酶活力的影響

        圖4 戊二醛濃度對酶活力的影響

        由圖4可知,戊二醛的濃度為3%時,固定化酶的相對酶活力達到最高值。

        2.2.4 交聯(lián)時間對酶活力的影響

        圖5 交聯(lián)時間對酶活力的影響

        由圖5可知,交聯(lián)時間為1.5 h時,相對酶活力最高。

        2.2.5 固定時間對酶活力的影響

        圖6 固定時間對酶活力的影響

        由圖6可知,固定時間為60 min時,相對酶活力最高。

        2.2.6 pH對酶活力的影響

        圖7 pH對酶活力的影響

        由圖7可知,當固定化體系pH 4.4時,固定化生姜蛋白酶相對酶活力最高。分析認為酶蛋白質(zhì)中的-NH2與戊二醛的醛基之間的加成反應,需要在酸性環(huán)境中進行。

        2.2.7 Fe3O4磁核量對酶活力的影響

        圖8 Fe3O4磁核量對酶活力的影響

        由圖8可知,當Fe3O4磁核量為3.0 mg/mL時,固定化酶相對酶活力最高。

        2.2.8 酶量對酶活力的影響

        圖9 酶量對酶活力的影響

        由圖9可知,1 g微球載體固定30 mg酶量時,相對酶活力最高。1 g微球載體固定的酶量<30 mg時,隨酶量的增加,固定化酶相對酶活力逐步上升;酶量超過30 mg時,固定化酶相對酶活力隨其增加呈下降趨勢。

        2.2.9 單因素試驗方差分析表

        表4 單因素試驗的方差分析

        由表4可知,借助SPSS處理單因素的試驗數(shù)據(jù),得出固定化生姜蛋白酶活力的影響因素大小關(guān)系為戊二醛濃度>Fe3O4磁核量>海藻酸鈉和明膠體積比>Fe2+∶Fe3+體積比>固定時間>交聯(lián)時間>酶量>pH。其中海藻酸鈉濃度、戊二醛濃度、Fe3O4磁核量3個因素的P值是影響固定化生姜蛋白酶的主要因素,F(xiàn)e2+∶Fe3+體積比影響不顯著,酶量、固定時間、交聯(lián)時間和pH影響的顯著性比海藻酸鈉濃度、戊二醛濃度、Fe3O4磁核量弱。下面應用響應面進行最優(yōu)分析時,設(shè)定Fe2+∶Fe3+體積比為0.75∶1,交聯(lián)時間為1.5 h,固定時間為60 min,pH值為4.4,酶量為30 mg/g進行工藝優(yōu)化。

        2.3 響應面試驗結(jié)果

        響應面試驗方案及結(jié)果見表5。

        表5 響應面試驗方案及結(jié)果

        用Design-Expert軟件對試驗結(jié)果進行擬合,以固定化生姜蛋白酶酶活力Y為響應值,對自變量海藻酸鈉濃度、戊二醛濃度、Fe3O4磁核量3個因素的回歸方程為:

        Y=50.2-0.12A+1.51B+1.11C+0.44AB-1.44AC-1.80A2-2.66B2-1.09C2。

        表6 回歸方程的方差分析

        注:P<0.05表示差異顯著;P<0.01表示差異極顯著。

        由表6可知,模型P值<0.05,說明該模型顯著;失擬項P值>0.05,說明該回歸擬合的情況良好,可以用其進行固定化酶活力的預測和分析。對于回歸方程各項的方差分析結(jié)果表明,方程的一次項B,C及二次項A2、B2和C2的P值均小于0.05,顯著;而交互項AB、AC、BC不顯著,說明此方程的擬合較充分。故各因素對固定化酶活力的影響依次為:戊二醛濃度>Fe3O4磁核量>海藻酸鈉濃度,與SPSS分析結(jié)果一致。

        去除不顯著的交互項AB、AC、BC,對表6進行二次多元回歸擬合,得到固定化酶活力對3個因素的二次多項回歸方程:

        Y=50.2-0.12A+1.51B+1.11C+0.44AB-1.44AC-1.80A2-2.66B2-1.09C2。

        經(jīng)優(yōu)化后,模型極顯著,失擬項不顯著,決定系數(shù)R2為0.9929,調(diào)整系數(shù)RAdj2為0.9892,預測系數(shù)RPred2為0.9699,說明測定值與模型預測值之間具有良好的相關(guān)度[11]。調(diào)整系數(shù)和預測系數(shù)值高且接近(RAdj2-RPred2<0.2),則回歸模型能充分說明工藝過程。

        2.4 響應面分析

        響應面圖形分析可以直觀地反映出各因素之間的交互作用對響應值的影響[12],3個因素各交互作用影響的響應面圖和等高線圖見圖10~圖15,響應面圖是三維空間立體圖,各試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關(guān)系,各因素之間的交互作用對響應值的影響與響應面的陡峭程度成正比,即交互作用對響應值影響越強,曲面越陡峭,反之則平緩[13],其曲面的最高區(qū)域存在最大值[14],即實驗結(jié)果y在試驗區(qū)域內(nèi)具有最大極值。通過回歸模型預測,給出固定化生姜蛋白酶的最佳工藝條件為Fe2+∶Fe3+體積比為0.75∶1、磁核量Fe3O4為3.0 mg/mL,海藻酸鈉與明膠體積比為2∶1,戊二醛濃度為3%,交聯(lián)時間為1.5 h,固定時間為60 min,pH值為4.4,酶量為30 mg/g,在此條件下酶活力的預測值為50.39 U/g。

        圖10 海藻酸鈉濃度和Fe3O4磁核量交互作用的響應面圖

        圖11 海藻酸鈉濃度和Fe3O4磁核量交互作用的等高線圖

        圖12 海藻酸鈉濃度和戊二醛濃度交互作用的響應面圖

        圖13 海藻酸鈉濃度和戊二醛濃度交互作用的等高線圖

        圖14 Fe3O4磁核量和戊二醛濃度交互作用的響應面圖

        圖15 Fe3O4磁核量和戊二醛濃度交互作用的等高線圖

        2.5 最佳固定條件的驗證

        單因素試驗結(jié)果與響應面試驗結(jié)果相結(jié)合,并通過響應面軟件分析得出回歸模型預測數(shù)值,得出固定化生姜蛋白酶的最佳工藝條件:Fe2+∶Fe3+體積比為0.75∶1,磁核量Fe3O4為3.0 mg/mL,海藻酸鈉與明膠體積比為2∶1,戊二醛濃度為3%,交聯(lián)時間為1.5 h,固定時間為60 min,pH值為4.4,酶量為30 mg/g,在此條件下酶活力的預測值為50.39 U/g。并以此條件進行3 次平行驗證實驗,固定化生姜蛋白酶的酶活力均值為52.63 U/g,誤差值很小,與預測值接近,證明了此模型的合理性。

        3 結(jié)論

        通過單因素試驗結(jié)合Box-Behnken響應面分析法進行優(yōu)化后,得到的磁性復合載體固定生姜蛋白酶的最佳工藝條件為:Fe2+∶Fe3+體積比為0.75∶1、磁核量Fe3O4為3.0 mg/mL、海藻酸鈉與明膠體積比為2∶1、戊二醛濃度3%、交聯(lián)時間1.5 h、固定時間60 min,pH值4.4、酶量30 mg/g。在此條件下,得到固定化生姜蛋白酶的酶活力為52.63 U/g,高于傳統(tǒng)固定制備法所得到的固定化酶酶活,且具有比游離酶良好的穩(wěn)定性。由此可見,磁性載體固定生姜蛋白酶是一種高效可行的固定化方法。

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