張 璐，馬金龍*

（大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600）

蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶，是酶學(xué)研究中較早也是最深入的一種酶。到21 世紀(jì)初，已經(jīng)報道的微生物蛋白酶預(yù)計超過900 種，是一種重要的工業(yè)化應(yīng)用酶制劑。本試驗利用大連海域高產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株，優(yōu)化其發(fā)酵條件，探究其降解羽毛粉的能力，實現(xiàn)海洋菌工業(yè)應(yīng)用價值。

1 試驗材料

1.1 菌種來源 實驗室貯存的大連海域產(chǎn)堿性蛋白酶芽孢桿菌DL12。

1.2 試驗試劑 蛋白胨、酵母粉、酸水解酪蛋白，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂，日本進口分裝；其余試劑均采用國產(chǎn)分析純。

1.3 斜面保藏培養(yǎng)基（LB）蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1%，瓊脂1%，pH 值7.0。

1.4 液體發(fā)酵培養(yǎng)基 酪蛋白酸水解物（干酪素）1%，葡萄糖1.5%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH 值7.0。

1.5 實驗儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱HPX-9052MBE，恒溫振蕩培養(yǎng)箱HNY-100B，高壓滅菌鍋MLS3020，高速冷凍離心機CF15RX，超凈工作臺SWCJ-1FD。

2 試驗方法

2.1 微生物的富集培養(yǎng) 將產(chǎn)堿性蛋白酶的細(xì)菌接種到固體培養(yǎng)基上活化，34℃培養(yǎng)48h，將活化后的菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，340rmp，搖床培養(yǎng)48h。

2.2 粗酶液的提取 取搖床培養(yǎng)48h 左右的發(fā)酵液200mL，在4℃下8000r/min 離心20min，取上清液，得粗酶液。

2.3 羽毛粉的降解 溫度組：將等量的羽毛粉分裝在7 個10ml 離心管內(nèi)，1 號管加入8mL 0.2%堿溶液，其余分別加入8mL 粗酶液；后取3～8 號管，置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下，所有樣品反應(yīng)30min；另取2 號離心管，加入8mL 粗酶液。取0.25mL 裝入1mL 離心管內(nèi)，并裝入等體積的5 倍樣品緩沖液。沸水加熱3～5min 后上樣。pH 組：將等量的羽毛粉分裝在8個10mL 離心管內(nèi)，1 號管加入8mL 0.2%堿溶液，其余分別加入8mL 粗酶液；后取3～9 號管，調(diào)節(jié)其pH 分別為6、7、8、9、10、11、12，所有樣品反應(yīng)30min；另取2 號離心管，加入8mL 粗酶液。取0.25ml 裝入1mL 離心管內(nèi)，并裝入等體積的5 倍樣品緩沖液。沸水加熱3～5min 后上樣。

2.4 電泳 運用SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳法對所制備的樣品分離，用考馬斯亮藍染色液染色，考馬斯亮藍脫色液脫色，得到試驗結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 溫度組 對電泳之后所得到的膠板反復(fù)脫色后，可以看到酶解羽毛粉溫度組的電泳條帶的酶解成果。通過肉眼觀察膠板可以看出，溫度組從20℃開始，隨著溫度的升高，酶解效果逐漸增強，在40℃時酶解效果最佳，在70℃時溫度過高，電泳條帶開始模糊。

3.2 pH 組 pH 組從pH 值7.0 開始，隨著pH 值的升高，酶解效果逐漸增強，在pH 值11.0 時酶解效果最佳，在pH 值12.0 時堿性過強，電泳條帶開始模糊。

圖1 溫度組電泳圖

圖2 pH 值酶解電泳圖

4 結(jié)論

綜上，可以在溫度為40℃，pH 值11.0 的條件下降解羽毛粉，得到最容易吸收的產(chǎn)品。