李戈輝， 吳 瑋， 邸銘洋， 王長城， 楊桂朋， 丁海兵**

(1. 中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室， 山東 青島 266100；2. 中國海洋大學化學化工學院， 山東 青島 266100； 3. 迪申生物技術(上海有限公司)， 上海 201201)

電泳[1]是帶電粒子在電場作用下向電性相反的電極移動的過程。電泳過程中，粒子所帶電荷數、分子大小、形狀等各不相同，從而在電場中有不同的移動速度而分離。聚丙烯酰胺電泳膠簡稱PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質，利用分子篩效應分離蛋白質和寡核苷酸。電泳過程中的蛋白質遷移率與分子量、形狀、電荷量均相關[2]。Shapiro于1967年提出SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)法，可僅憑分子量不同分離蛋白質[3]。1970年，Laemmli完善了不連續(xù)電泳技術，用于分離大分子蛋白。不連續(xù)緩沖體系由電泳緩沖液、堆積膠、分離膠組成。蛋白質樣品在堆積膠中經過大孔徑凝膠的堆積效應被濃縮在一個狹窄的區(qū)帶，形成相同的分離起點；蛋白質進入分離膠后，較小孔徑凝膠的分子篩效應將它們分離開[4]。經過多年發(fā)展，SDS-PAGE具備了分辨率高、重復性較好、靈敏度高、上樣量少等特點，成為廣泛應用的蛋白質分離方法[2]。

目前實驗室常用的Laemmli法配制的SDS-PAGE膠雖然優(yōu)點突出，但存在保質期短、耐受電壓較低、電泳時間長等問題。一些生命科學公司研發(fā)了預制膠產品，在保持Laemmli膠良好分離性能的基礎上，縮短了電泳時間，延長了電泳膠的保質期。例如Bio-Rad公司的一種蛋白質凝膠適用電壓為200～300 V，電泳時間在30 min左右，在2～8 ℃時保質期為12個月；EZBiolab的預制膠適用電壓為150 V，電泳時間在40～50 min，4 ℃時可保存18個月。但目前市場上流行的預制膠價格較高，電泳時間仍然較長，且使用時受限于與之相匹配的電泳系統(tǒng)。制備一種兼?zhèn)銵aemmli膠分離性能和易制備特性，且擁有商業(yè)預制膠較長保質期優(yōu)點的電泳膠十分必要。到目前為止，這方面的主要進展是邸銘洋等用三異丙醇胺代替Laemmli膠中的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽(Tris-HCl)作為緩沖物質，制備了聚丙烯酰胺濃度為7.5%的電泳膠[5]。初步研究表明，這種電泳膠對蛋白質標準有良好的分離效果并具有較長的保質期。

本研究在探究影響電泳膠的保質期關鍵因素的基礎上，以三異丙醇胺和三乙醇胺代替Tris-HCl作為緩沖物質，制備了含有不同濃度聚丙烯酰胺的兩種新型電泳膠。對它們性能的全面研究表明，這兩種新型電泳膠均保持了Laemmli膠良好的蛋白質分離性能，適用電壓和耐受的最高電壓均高于目前市場上流行的商業(yè)電泳膠，電泳速度更快，保質期更長，具備良好的應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器 pH計(PB-10，賽多利斯科學儀器有限公司)；電泳儀(BG-Power 600K，北京百晶生物技術有限公司)；垂直槽制膠支架、垂直電泳槽(VE-180，上海天能科技有限公司)；分析天平(CP214，奧豪斯儀器(上海)有限公司)；電子天平(TD20002A，余姚市金諾天平儀器有限公司)；光照培養(yǎng)箱(GXZ-250A，寧波江南儀器廠)；真空封口機(DZ-280/2SE，東莞市金橋科技電器制造有限公司)；超聲波清洗機(SB-5200，寧波新芝生物科技股份有限公司)。

試劑 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl，99.9%)、十二烷基硫酸鈉(SDS，99.9%)、鹽酸(優(yōu)級純)、冰醋酸(分析純)、甲醇(分析純)(國藥集團化學試劑有限公司)；N,N-亞甲基二丙烯酰胺單體(Bis，99%)、過硫酸銨(APS，98%)、?；撬?99%)、三乙醇胺(97%)、三異丙醇胺(99.5%)、乙醇酸(99%)、甘氨酸(98.5%)(Sigma-Aldrich有限公司)；丙烯酰胺單體(Acr，99.9%)、N,N,N(,N(-四甲基乙二胺(TEMED，98%)，考馬斯亮藍R250(Decentbio公司)；預染色蛋白質標準和未染色蛋白質標準(BBI生命科學有限公司)；預制電泳膠(Bio-Rad公司，分離膠濃度分別為7.5%、10%、12%、15%)。

1.2 實驗方法

1.2.1 電泳膠的制備 制備分離膠濃度為7.5%、10%、12%、15%的Laemmli膠、新型I、新型II電泳膠若干塊，用于檢驗其最大耐受電壓和保質期。電泳膠配方如表1、2所示。通常濃度為3%～5%的堆積膠對蛋白質有明顯的濃縮作用[6]，本研究配制堆積膠濃度為4%。制備電泳膠時，APS和TEMED最后加入，其他溶液需要先充分混合均勻并排氣，否則影響電泳膠凝固速度。灌入分離膠后用Milli-Q水液封，以減少空氣對APS產生自由基反應的不利影響，加速凝固過程。待分離膠凝固完全，沖洗殘留試劑，灌入堆積膠，插入梳子。堆積膠凝固后，若當天進行電泳，則將梳子取出并沖洗加樣孔，備用。在檢驗電泳膠保質期實驗中，電泳膠梳子保留，放入塑料封口袋中，填充適量電泳緩沖液，用真空封口機抽氣并密封，置于恒溫培養(yǎng)箱中。

表1 4%堆積膠配方(總體積10 mL)

續(xù)表1

1.2.2 電泳膠最大耐受電壓測定 電泳緩沖液含有25 mmol/L Tris，192 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS。將電泳膠安裝在電泳槽內，電泳槽注入緩沖液，使電泳膠的上端和下端浸入其中，取5 μL預染色蛋白質標準或未染色蛋白質標準注入上樣孔。電泳開始時，采用較低電壓使蛋白質在堆積膠中濃縮成狹窄的區(qū)帶。增大電壓使蛋白質進入分離膠。當蛋白質標準的指示劑前沿接近電泳膠底部時，電泳結束。測量蛋白質條帶到指示劑的長度，以及兩膠界面到指示劑的長度，由二者比值計算相對遷移率m。

未染色蛋白質標準經15～20 min染色、4～6 h脫色后測量計算m(染色液為0.25%的考馬斯亮藍R250溶液，溶劑為水、甲醇、冰醋酸按照約5∶5∶1體積比混合；脫色液成分為水、甲醇、冰醋酸按照約6∶3∶1體積比混合)[7]。

當蛋白質分子量在15～200 kD時，蛋白質的分子量的對數與相對遷移率的關系符合下式：

lgMW=km+b。

式中：MW為蛋白質相對分子量，在15～200 kD之間時，MW與相對遷移率m呈線性關系；k為斜率；b為截距，該方法測定蛋白質分子量的相對誤差為±10%[8]。根據蛋白質分子量對遷移率曲線擬合度R2的數值，結合電泳條帶圖像，以判斷蛋白質的分離效果。測試不同濃度Laemmli膠、新型I和新型II電泳膠以及預制膠的最大耐受電壓(即能維持mvs. lgMW曲線擬合度不低于0.990 0的電壓)，并在最大電壓下對比各電泳膠對蛋白質的分離情況。

1.2.3 電泳膠的加速壽命實驗 加速壽命實驗用以檢驗的Laemmli膠、新型I、新型II電泳膠以及預制膠的保質期。將Laemmli膠、新型I、新型II電泳膠和Bio-Rad預制膠置于恒溫培養(yǎng)箱中(分離膠濃度均為10%)，調節(jié)至37 ℃恒溫保存。在第6、9、12、15天分別將膠取出進行電泳，檢驗其對蛋白質的分離效果。若電泳膠出現(xiàn)氣泡、漏膠或變形，則不進行電泳，視作該電泳膠已經達到最長保質期。

1.2.4 電泳膠變質過程中表觀活化能的估算 電泳膠變質是復雜的反應。依據阿倫尼烏斯公式，結合不同保存溫度條件下電泳膠的保質期，可計算幾種電泳膠變質過程中的表觀活化能。活化能反映化學反應速度，在本研究中可作為比較幾種電泳膠的變質速度的一種依據。重復1.2.3中步驟，但將電泳膠保存溫度設置為45 ℃，檢驗它們在該溫度下的保質期。跟據電泳膠在37和45 ℃的保質期，計算電泳膠的表觀活化能，從而能夠從理論上計算電泳膠在一般儲存條件(4 ℃)下的變質時間。

表2 x%分離膠配方(總體積10 mL)Table 2 Formulation of x% separation gel(Total volume 10 mL)

表觀活化能計算方法如下：

式中：k是溫度為T時的反應速率常數；R是氣體摩爾常數；A是指前因子；Ea為表觀活化能。

A是與T無關的常數，兩邊求微分：

當溫度分別為T1和T2時，反應速率常數分別為k1和k2，則：

兩式相減得：

(1)

設溫度為T1時的反應速率為k1，反應時間為t1；溫度T2的反應速率為k2，反應時間為t2。假設幾種電泳膠變質的反應程度基本相同，則

t1k1=t2k2。

(2)

將實驗溫度、相應的保質期代入(a) (b)式，聯(lián)立得到表觀活化能Ea的估算值。

2 結果與討論

2.1 電泳膠凝固時間

在室溫下(25 ℃)，制備的各類電泳膠凝固時間如表3所示。新型I電泳膠所需的凝固時間最短，Laemmli膠所需時間最長。新型I、新型II電泳膠相對于Laemmli膠凝固速度更快，主要與?；撬岬募尤肓坑嘘P。在一定范圍內，?；撬釢舛仍礁撸娪灸z凝固速度越快[5]。此外，經實驗驗證，未排氣的新型電泳膠混合液難以凝固。

表3 電泳膠凝固時間(體積10 mL，濃度10%)

2.2 電泳膠的最大耐受電壓和分離性能

實驗結果表明，不同濃度的Bio-Rad預制膠、新型I、新型II電泳膠的最大耐受電壓均在350 V左右，各類電泳膠在一般工作電壓和最大耐受電壓下的電泳耗時如表4所示。Laemmli膠最大耐受電壓約為240 V，不宜在350 V電壓條件下電泳。

表4 不同電壓下電泳耗時(10%分離膠)

在最大耐受電壓350 V下的各類電泳膠的電泳時間如表5所示，電泳圖像如圖1所示。表5中擬合度R2為2～3次電泳結果的平均值。圖1中，各條帶分子量(kDa)從上到下依次為：130，100，70(橙色)，50，35，25，20，15。

((a),(d),(g),(j)為7.5%、10%、12%、15%的Bio-Rad預制膠；(b),(e),(h),(k) 為7.5%、10%、12%、15%的新型Ⅰ電泳膠；(c),(f),(i),(l) 為7.5%、10%、12%、15%的新型II電泳膠。(a),(d),(g),(j): 7.5%, 10%, 12%, 15% Bio-Rad Gel;(b),(e),(h),(k):7.5%, 10%, 12%, 15% New electrophoresis gel I; (c),(f),(i),(l): 7.5%, 10%, 12%, 15% New electrophoresis gel II.)

表5 標準曲線擬合度及電泳用時

在350 V電壓下，預染色標準蛋白的電泳時間隨分離膠濃度升高而增加。在同等濃度分離膠中，標準蛋白在新型I電泳膠中電泳速度最快，在預制膠中次之，在新型II電泳膠中電泳速度最慢。電泳過程中蛋白質的遷移速度與緩沖體系、支持介質性質等密切相關，由于新型I、II新型電泳膠中分別以三異丙醇胺和三乙醇胺作為緩沖組分，相同條件下兩種電泳膠的電泳時間差異顯著。

表5、圖1結果表明，350 V電壓條件下，不同濃度新型I和新型II電泳膠均能獲得清晰的分離條帶，標準曲線擬合度良好，其中新型I電泳膠R2波動范圍最小，Bio-Rad預制膠的擬合度波動范圍最大。比較幾種電泳膠的R2平均值，新型I電泳膠的平均分離性能最佳。分離膠濃度較高時(15%)，Bio-Rad預制膠、新型II電泳膠的部分蛋白質條帶出現(xiàn)模糊、擴散的現(xiàn)象，可能是電泳耗時較長，產生熱量較多，電泳系統(tǒng)溫度升高導致電泳膠分離能力下降。根據mvs. lgMW曲線方程，計算出的蛋白質分子量，與已知的標準分子量對比的結果表明，實驗測得的分子量在Bio-Rad預制膠、新型I電泳膠、新型II電泳膠中的相對誤差分別為0.45%、0.26%、0.36%，新型I電泳膠測定蛋白質分子量時的相對誤差最小。新型I、新型II電泳膠和Bio-Rda預制膠中的未染色蛋白質標準的遷移率曲線與上述結果相近，兩種新型電泳膠染色、脫色效果良好，條帶清晰。

2.3 電泳膠保質期的確定

將在37 ℃恒溫保存的Laemmli膠、新型I、新型II電泳膠和Bio-Rad預制膠在第6、9、12天取出進行電泳，電泳圖片如圖2所示。各類電泳膠保質期如表6所示。在37 ℃條件下加速壽命實驗結果表明，第6天Laemmli膠對蛋白質的分離能力明顯下降，蛋白質條帶出現(xiàn)模糊、擴散和變形，并且存在拖尾現(xiàn)象。6天之后的Laemmli膠出現(xiàn)氣泡和漏膠現(xiàn)象，不宜進行電泳。

表6 電泳膠加速壽命實驗保質期與表觀活化能

第6天時兩種新型電泳膠分離蛋白質的條帶均比較清晰，且標準曲線擬合度均優(yōu)于Laemmli膠，新型I電泳膠的線性關系最好。Bio-Rad預制膠標準曲線擬合度較好，但蛋白質條帶出現(xiàn)擴散現(xiàn)象。第9天新型I、新型II電泳膠的標準曲線擬合度仍在0.980 0以上，所得蛋白質條帶較清晰；而Bio-Rad預制膠中所得的蛋白質條帶出現(xiàn)明顯的模糊擴散現(xiàn)象，對蛋白質分離效果明顯降低。第12天新型I、新型II電泳膠中所得的蛋白質條帶出現(xiàn)輕微擴散和拖尾，標準曲線擬合度略有下降，分離能力仍然較好。新型I電泳膠標準曲線的擬合度更高。兩種新型電泳膠均未出現(xiàn)變形、氣泡，表明它們性質穩(wěn)定，能在較長時間內保持蛋白質分離性能，保質期顯著優(yōu)于Bio-Rad公司的預制膠。Bio-Rad預制膠在保存第9天后出現(xiàn)變形和氣泡，而新型I、新型II電泳膠分別在第15、14天出現(xiàn)氣泡。

理論上，Laemmli膠中的Tris-HCl，以及兩種新型電泳膠中的三乙醇胺和三異丙醇胺都屬于胺類。胺類是典型的親核試劑，能夠親核攻擊酰胺基團帶正電的碳原子，進行胺交換反應。因此，這三種胺都有破壞聚丙烯酰胺三維網狀結構的可能性。這三種親核試劑中，Tris-HCl是伯胺，發(fā)生胺交換反應相對更容易，但反應條件也比較苛刻(在酸性或堿性條件使酰胺鍵的穩(wěn)定性受到破壞)；經過較長的時間，其—NH2基團與聚丙烯酰胺會逐漸發(fā)生反應，如圖3(a)所示，反應使交聯(lián)結構的酰胺鍵斷開，三維網狀結構遭到破壞，電泳膠逐漸失去了分子篩效應，分離能力下降[5]。三乙醇胺和三異丙醇胺都是叔胺，對酰胺進行親核攻擊非常困難，甚至無法進行。同時，兩種新型電泳膠中的甘氨酸成分有利于保持它們的空間網狀結構，并減輕蛋白質條帶的拖尾情況。兩種新型電泳膠配方中Tris的含量遠低于Laemmli膠，并采用?；撬?、乙醇酸作為緩沖成分，通過調節(jié)pH減少聚丙烯酰胺的中酰胺鍵在酸性條件下被破壞的程度，從而延長了電泳膠的保質期[5]。從圖3(b，c)可以看出，三異丙醇胺與三乙醇胺雖然性質相似，但三異丙醇胺立體空間結構相對于三乙醇胺具有更強的支撐、分散性能，且與酰胺鍵發(fā)生反應時的空間位阻更大，變質過程更加緩慢。以上分析表明，新型I電泳的保質期應該長于新型II電泳膠并遠遠長于Laemmli膠，與我們的實驗結果相符。電泳膠穩(wěn)定性的增強也有助于其耐受更高的電壓，使兩種新型電泳膠能夠承受350 V的電壓，耐壓性能顯著高于Laemmli膠。

圖3 (a) 酸性條件下Tris與酰胺鍵反應;(b)三乙醇胺結構和(c)三異丙醇胺結構

Rowell 等人的研究表明，SDS-PAGE在37 ℃下恒溫保存1天約等于4 ℃下恒溫保存1個月[9]。由于Bio-Rad預制膠使用時，距離生產日期約2個月，通過換算后該預制膠保質期為11～12個月，與產品說明基本相符。根據Rowell的結果推斷，在4 ℃冷藏條件下，新型I、新型II電泳膠可以分別保存約15、14個月，保質期較Bio-Rad預制膠更長，明顯長于Laemmli膠。

2.4 電泳膠變質過程的表觀活化能

兩種新型電泳膠和Laemmli膠保質期的結果都是根據較高溫度下加速實驗的結果推定的。通過計算電泳膠變質過程中的表觀活化能，能夠推算電泳膠在理論上的保質期。四種電泳膠變質過程的表觀活化能如表6所示。幾種電泳膠表觀活化能由大到小排序為：新型I電泳膠、新型II電泳膠、Bio-Rad預制膠、Laemmli膠。表觀活化能數值越高，反應進行越慢，這進一步說明了新型I電泳膠具有更加穩(wěn)定的化學性質，從而具有較長的保質期。根據表觀活化能推算電泳膠在4 ℃儲存條件下的理論保質期列于表6，其中新型I電泳膠保質期最長，可達3年以上。根據表觀活化能計算的四種電泳膠的保質期比根據Rowell研究結果推算的保質期明顯偏長，因此需要進一步通過實驗驗證這四種電泳膠在4 ℃下的確切的保質期。

2.5 Laemmli膠和兩種新型電泳膠的理化參數

Laemmli膠和兩種新型電泳膠的部分理化參數如表7所示。

表7 三種電泳膠部分理化參數(10%分離膠)

3 結語

最大電壓耐受實驗和加速壽命實驗結果表明，新型I和新型II電泳膠具備了Laemmli膠對蛋白質良好的分離性能，并且制膠時凝固速度更快；耐受工作電壓高達350 V，完成電泳時間更短；新型I和新型II電泳膠配方中的緩沖物質三異丙醇胺和三乙醇胺能有效保護聚丙烯酰胺的三維網狀結構，保質期超過現(xiàn)有的商業(yè)預制膠，具有良好的應用前景。