韓 萃， 魏發(fā)奕， 李 麗,2**， 董雙林,2， 高勤峰,2

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

鮭科魚類富含長鏈不飽和脂肪酸、氨基酸、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，深受廣大消費(fèi)者青睞[1-3]。隨著中國鮭科魚類市場需求量逐年上升，鮭科魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)逐漸興起[3]。虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鮭(Salmosalar)和銀鮭(O.kisutch)是目前中國主要養(yǎng)殖的鮭科魚種類，其養(yǎng)殖模式以水庫低溫水養(yǎng)殖和循環(huán)水養(yǎng)殖為主，其中絕大部分以淡水養(yǎng)殖，少數(shù)以半咸水或海水養(yǎng)殖[4]。然而，低鹽度養(yǎng)殖魚類的異味問題對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大沖擊[5-6]，異味中又以土腥味最為嚴(yán)重。

目前認(rèn)為水體中產(chǎn)生的土腥味物質(zhì)有5種，即土臭素(Geosmin，GSM)、二甲基異茨醇(2-methylisoborneol，MIB)、2-isobutyl-3-methoxy-pyrazine(IBMP)、2-isopropyl-3-methoxy-pyrazine(IPMP)、2,3,6-trichloroanisole(TCA)，其中以GSM和MIB最為常見[7-8]。水環(huán)境中GSM和MIB的含量分別達(dá)到9和4 ng·L-1，就能使水產(chǎn)品產(chǎn)生土腥味[9]。魚肉中GSM或MIB任一含量超過0.7 μg·kg-1，這種魚類就帶有土腥味[10]。

魚類產(chǎn)生土腥味的原因通常是由于水體污染，造成某些種類的浮游藻類和放線菌生長過剩，不斷產(chǎn)生和分泌異味物質(zhì)到水中[11]，進(jìn)而滲透到魚體中。因此，水質(zhì)是影響土腥味物質(zhì)產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。大量研究表明，鹽度、溫度、光照、水中磷含量、總懸浮固體含量等均能顯著影響土腥味物質(zhì)的產(chǎn)生[12-17]。另外，有研究指出土腥味物質(zhì)能在脂含量豐富的組織中積累，MIB和GSM在魚體中的分布可能因組織和規(guī)格不同而異[18-19]，但目前鮮有這方面的研究。

本文比較了不同規(guī)格虹鱒和虹鱒不同組織中GSM和MIB含量，研究土腥味物質(zhì)在虹鱒體內(nèi)的分布規(guī)律。另外比較了虹鱒、大西洋鮭和銀鮭體內(nèi)的GSM和MIB含量及其養(yǎng)殖水體水質(zhì)，分析了魚體中GSM和MIB與水質(zhì)因子的關(guān)系。以期發(fā)現(xiàn)土腥味物質(zhì)在鮭科魚體內(nèi)的蓄積規(guī)律，篩選出影響鮭科魚體內(nèi)土腥味含量的關(guān)鍵水質(zhì)因子。本研究將為優(yōu)化鮭科魚類養(yǎng)殖模式以及提升養(yǎng)殖魚類品質(zhì)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在甘肅某養(yǎng)殖場采集4種規(guī)格((351.00±11.27)、(1 216.67±57.74)、(1 650.00±50.00)和(3 050.00±86.60) g)虹鱒各3尾。另外分別于2018年7月在甘肅、山東煙臺(tái)和山東東營采集虹鱒、大西洋鮭和銀鮭各6尾，甘肅養(yǎng)殖場采用天然水庫網(wǎng)箱養(yǎng)殖方式，山東煙臺(tái)和山東東營養(yǎng)殖場采用循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖方式。投喂飼料均為鮭鱒成魚配合飼料6.0(北京漢業(yè)科技有限公司)。采集的魚類樣本經(jīng)MS-222麻醉后，測定其體長和體重，然后取其背肌、肝臟和魚皮組織用真空袋密封(21 cm×23 cm，HandheldVac，中國)，置于干冰中運(yùn)回中國海洋大學(xué)養(yǎng)殖生態(tài)實(shí)驗(yàn)室后，于-80 ℃冰箱保存。

取1 L水樣加入HgCl2固定，每個(gè)采樣點(diǎn)3個(gè)重復(fù)，置于干冰中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后迅速測定水質(zhì)指標(biāo)。

1.2 水質(zhì)及脂含量測定

養(yǎng)殖用水的溫度(T)、溶解氧(DO)、pH和鹽度值均采用YSI-6920多參數(shù)水質(zhì)分析儀(Yellow Springs Instruments，USA)進(jìn)行現(xiàn)場測定。

取部分背肌樣品，經(jīng)冷凍干燥，研磨成粉后，采用索氏抽提法測定其脂含量[21]，剩余背肌樣品用于測定土腥味物質(zhì)。

1.3 土腥味物質(zhì)分析

1.3.1 土腥味物質(zhì)提取 采用微波蒸餾裝置(見圖1)提取魚組織中的土腥味物質(zhì)：微波加熱功率為350 W，氮?dú)饬魉贋?0 mL·min-1。氮?dú)鈱饣漠愇段镔|(zhì)帶出，經(jīng)冷凝裝置對(duì)其冷凝液化后，收集餾分。

圖1 微波蒸餾裝置示意圖

取10 mL餾分于20 mL頂空瓶(美國Agilent公司)中，再加入3 g NaCl和微型磁力攪拌子，立即用帶PTFE涂層硅橡膠墊的瓶蓋密封。將頂空瓶置于加熱磁力攪拌臺(tái)(IKA? RCT basic加熱型磁力攪拌器，德國IKA公司)上，將50/30 DVB/CAR/PDMS萃取頭(美國Supelco公司)插入瓶內(nèi)頂空吸附，攪拌速度1 500 r·min-1，60 ℃萃取45 min。隨后取出萃取頭迅速插入氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)進(jìn)樣口，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用分析。

1.3.2 土腥味物質(zhì)測定 GC-MS聯(lián)用使用的色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱(美國Agilent公司，30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；采用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250 ℃，熱解析15 min；程序升溫：初溫40 ℃，保持2 min，以8 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持10 min；載氣：He；流量：0.8 mL·min-1，不分流；質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃。數(shù)據(jù)采集：TIC(Total Ion Chromatograms，總離子流色譜圖)；EIC(Extract Ion Chromatograms，選擇離子色譜圖)，GSM和2-MIB的定量特征離子質(zhì)荷比m/z分別為112和95。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)方法分別進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。若符合正態(tài)分布且方差齊，組間差異采用ANOVA單因素方差及Turkey多重比較法進(jìn)行分析。相關(guān)性分析采用Pearson分析方法，顯著水平P<0.05。所有分析均由SPSS 19.0軟件實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 虹鱒不同組織中的土腥味物質(zhì)含量差異

虹鱒不同組織中的MIB和GSM含量見圖2。在肝臟、肌肉和魚皮中，MIB含量較GSM高。MIB和GSM在肝臟中積累最多，其次是肌肉，最后是魚皮，經(jīng)差異分析得出，肝臟、肌肉和魚皮中MIB和GSM含量存在顯著差異(P<0.05)。MIB在肝臟、肌肉和魚皮中的含量分別為(2.89±0.34)、(0.94±0.20)和(0.28±0.05) μg·kg-1。GSM在肝臟、肌肉和魚皮中的含量分別為(1.18±0.08)、(0.63±0.08)和(0.12±0.03) μg·kg-1。

(不同大寫字母表示MIB含量在虹鱒不同組織間差異顯著P<0.05，不同小寫字母表示GSM含量在虹鱒不同組織間差異顯著P<0.05。Different capital letters indicate that the concentration of MIB varies significantly among different tissues of rainbow trout P<0.05，while different lower-case letters indicate that the concentration of GSM varies significantly among different tissues of rainbow trout P<0.05.)

2.2 不同規(guī)格虹鱒體內(nèi)土腥味物質(zhì)含量比較

如表1所示，不同規(guī)格的虹鱒，其體重、體長及脂含量存在顯著差異(P<0.05)，此外，隨著虹鱒規(guī)格增大，其背肌脂含量增高。

表1 不同規(guī)格虹鱒的體重、體長及脂含量

不同規(guī)格虹鱒背肌中MIB和GSM含量如圖3所示，兩種物質(zhì)含量均隨規(guī)格增加而升高，不同規(guī)格虹鱒體內(nèi)兩種物質(zhì)含量差異及其顯著(MIB：P=0.003；GSM：P=0.002)，虹鱒體內(nèi)兩種物質(zhì)含量均是規(guī)格C和D的顯著高于規(guī)格A的(P<0.05)，規(guī)格B與其他規(guī)格無顯著差異(P>0.05)。另外，4個(gè)規(guī)格的虹鱒背肌中均是MIB含量高于GSM含量，規(guī)格C和D的虹鱒背肌中MIB含量超過了0.7 μg·kg-1，分別達(dá)到了(0.79±0.12)和(0.94±0.20) μg·kg-1。4個(gè)規(guī)格的虹鱒背肌中GSM含量均低于0.7 μg·kg-1。

(不同大寫字母表示MIB含量在不同規(guī)格虹鱒體內(nèi)差異顯著P<0.05，不同小寫字母表示GSM含量在不同規(guī)格虹鱒體內(nèi)差異顯著P<0.05。Different capital letters indicate that the concentration of MIB varies significantly among different sizes of rainbow trout P<0.05，while different lower-case letters indicate that the concentration of GSM varies significantly among different sizes of rainbow trout P<0.05.)

經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，虹鱒背肌中的MIB和GSM含量與虹鱒體重、體長及脂含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05, 見表2)。虹鱒背肌中的MIB和GSM與虹鱒體重的相關(guān)系數(shù)分別為0.84和0.84，與虹鱒體長的相關(guān)系數(shù)分別為0.89和0.86，與虹鱒背肌脂含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.80和0.76。

表2 虹鱒體內(nèi)MIB和GSM含量與虹鱒體重、體長及脂含量的相關(guān)性分析

2.3 魚體內(nèi)土腥味物質(zhì)含量與水質(zhì)的關(guān)系

2.3.1不同種類鮭科魚體內(nèi)土腥味含量 銀鮭、虹鱒和大西洋鮭背肌中MIB和GSM含量如圖4所示。虹鱒體內(nèi)的MIB含量顯著高于銀鮭和大西洋鮭體內(nèi)的(P<0.01)，達(dá)到了0.73 μg·kg-1。銀鮭和大西洋鮭背肌中MIB含量無顯著差異，P>0.05。GSM的含量排列順序?yàn)椋恒y鮭>虹鱒>大西洋鮭，銀鮭、虹鱒和大西洋鮭體內(nèi)GSM的含量分別達(dá)到了4.58、0.48和0.02 μg·kg-1，種類間GSM含量差異極其顯著(P<0.01)。

(不同大寫字母表示MIB含量在不同種類間差異顯著P<0.05，不同小寫字母表示GSM含量在不同種類間差異顯著P<0.05。Different capital letters indicate that the concentration of MIB varies significantly in different species P<0.05，while different lower-case letters indicate that the concentration of GSM varies significantly in different species P<0.05.)

2.3.2 不同養(yǎng)殖水體水質(zhì)比較 本文比較了3種鮭科魚類養(yǎng)殖水體的水質(zhì)，如表3所示。3種鮭科魚養(yǎng)殖水體中溫度、pH及溶解氧的范圍分別為15.3～20.3 ℃、6.85～8.46、6.96～12.05 mg·L-1，其中，虹鱒養(yǎng)殖用水水溫最高、溶解氧含量最低，分別為20.3 ℃和6.96 mg·L-1。虹鱒、銀鮭和大西洋鮭的養(yǎng)殖用水分別為淡水、半咸水及海水，鹽度分別為0.2、15.0和30.1。氨氮、活性磷及總磷在銀鮭養(yǎng)殖用水中最高，硝氮、亞硝氮、總氮及總懸浮物固體含量在大西洋鮭養(yǎng)殖用水中最高，分別為3.43 mg·L-1、0.21 mg·L-1、7.57 mg·L-1和0.14 g·L-1。經(jīng)差異分析，所有水質(zhì)指標(biāo)在3種鮭科魚類養(yǎng)殖水體間均存在顯著差異(P<0.01)。

表3 不同種類鮭科魚養(yǎng)殖用水水質(zhì)

2.3.3 魚體內(nèi)土腥味物質(zhì)含量與水質(zhì)的相關(guān)性 對(duì)鮭科魚體內(nèi)的土腥味物質(zhì)(MIB和GSM)與水質(zhì)因子進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明，魚體中MIB含量與水溫和pH呈顯著正相關(guān)(見表4，P<0.05)，與鹽度、溶解氧、氨氮、總磷及總懸浮物固體呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。魚體中GSM含量與氨氮、活性磷及總磷呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與亞硝氮、硝氮及總氮呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表4 魚體MIB和GSM含量與水質(zhì)的相關(guān)性分析

3 討論

3.1 鮭科魚類土腥味物質(zhì)含量

近幾年，養(yǎng)殖鮭科魚類的土腥味問題時(shí)常被報(bào)道。本文測得虹鱒體內(nèi)MIB含量和銀鮭體內(nèi)GSM含量分別為(0.73±0.22)和(4.58±0.23) μg·kg-1，超出了人類感官閾值0.7 μg·kg-1。國外許多學(xué)者也對(duì)養(yǎng)殖鮭科魚的土腥味問題進(jìn)行了研究，根據(jù)已發(fā)表數(shù)據(jù)，鮭科魚體內(nèi)MIB和GSM的含量范圍為0～0.99 μg·kg-1和0.1～7.2 μg·kg-1[14,22]，部分魚類有明顯的土腥味。由此看來，土腥味問題在鮭科魚養(yǎng)殖業(yè)中普遍存在。因此，研究影響魚類土腥味產(chǎn)生及分布的因素對(duì)魚類土腥味控制有實(shí)際參考價(jià)值。

3.2 MIB和GSM在虹鱒體內(nèi)的分布規(guī)律

水體中的土腥味物質(zhì)能通過魚鰓、體表和腸上皮細(xì)胞進(jìn)入魚體內(nèi)[19]，在富含脂質(zhì)的組織如魚皮和內(nèi)臟中富集[19]。本文比較了虹鱒背肌、肝臟以及魚皮中MIB和GSM的含量，發(fā)現(xiàn)兩種異味物質(zhì)均在虹鱒肝臟中積累最多，肝臟中的MIB的含量是背肌中的3倍，魚皮中的10倍。肝臟中GSM的含量是背肌中的2倍，魚皮中的10倍。因此，MIB和GSM在魚體中的分布因組織不同而異，相比于肌肉和魚皮組織，肝臟能積累更多的土腥味物質(zhì)。目前鮮有對(duì)魚類不同組織中土腥味物質(zhì)含量比較及其蓄積機(jī)制的研究，因此不同組織對(duì)土腥味物質(zhì)的富集途徑還不清楚。

本實(shí)驗(yàn)測得養(yǎng)殖在相同水體中的虹鱒，規(guī)格越大，背肌中MIB和GSM含量也越高。有研究表明，GSM和MIB屬于親脂性化合物，能在脂肪中積累[23]，GSM和MIB在魚體內(nèi)的富集能力取決于魚體脂肪含量。本文測定了不同規(guī)格的虹鱒肌肉脂含量，表明脂含量隨規(guī)格增加而上升，相關(guān)性分析得出虹鱒背肌脂含量與MIB和GSM含量顯著正相關(guān)。相似的是，Yarnpakdee等[19]也發(fā)現(xiàn)脂含量較高的魚體肌肉中MIB和GSM含量也較高，尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)和斑點(diǎn)胡子鯰(Clariasmacrocephalus)腹部肌肉脂肪較背部肌肉豐富，腹部肌肉中GSM和MIB的含量要高于背部肌肉中的。因此，脂含量較高的魚體內(nèi)會(huì)富集更多的GSM和MIB。

魚體中的土腥味物質(zhì)主要源于水環(huán)境。Petersen等[24]研究了水體中MIB和GSM與虹鱒體內(nèi)的MIB和GSM關(guān)系，指出水中的GSM超過20 ng·L-1時(shí)，96%的魚有強(qiáng)烈的土腥味，低于10 ng·L-1時(shí)，18%的魚有強(qiáng)烈的土腥味。Petersen等[24]建議為確保虹鱒的風(fēng)味品質(zhì)，其養(yǎng)殖水體中GSM和MIB的含量之和不能超過10 ng·L-1。本文得出結(jié)論，魚體脂含量能影響魚體土腥味物質(zhì)的富集，因此，在養(yǎng)殖脂含量較高的魚類時(shí)，要求養(yǎng)殖水體中土腥味物質(zhì)的含量要更低。

3.3 魚體背肌土腥味物質(zhì)含量與水質(zhì)的關(guān)系

MIB和GSM是萜類化合物，主要由藍(lán)綠藻和放線菌類產(chǎn)生[12,25]。已有大量研究指出了放線菌和藍(lán)藻合成MIB和GSM的途徑[25-29]。因此，控制養(yǎng)殖水體中藍(lán)藻和放線菌的數(shù)量是解決土腥味問題的關(guān)鍵，而養(yǎng)殖水體中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能與水質(zhì)息息相關(guān)。

本文中相關(guān)性分析得出魚體內(nèi)MIB含量與水溫和pH呈顯著正相關(guān)關(guān)系。大量研究表明溫度會(huì)顯著影響產(chǎn)生MIB微生物的代謝[14-16，30-33]。弱堿(pH為8～9)條件能促進(jìn)某些顫藻釋放異味物質(zhì)[34-35]。本文測得虹鱒養(yǎng)殖水體也偏弱堿性(pH=8.46)。因此溫度超過20 ℃和偏弱堿性的環(huán)境可能促進(jìn)了某些產(chǎn)MIB的藍(lán)藻或放線菌的生長和代謝，導(dǎo)致產(chǎn)生大量的MIB滲透到魚體中。本文中相關(guān)性研究表明魚體內(nèi)GSM含量與養(yǎng)殖水體中的氨氮、總磷和溶解性活性磷濃度呈顯著正相關(guān)。朱健明等[36]研究發(fā)現(xiàn)鰱體內(nèi)GSM含量與總磷濃度存在顯著相關(guān)性。Dzialowski等[17]研究也指出溶解性活性磷的含量是影響GSM產(chǎn)生的重要決定因素。因此，養(yǎng)殖水體中的氨氮和磷可能為某些產(chǎn)生GSM的微生物提供了營養(yǎng)條件[37-39]，從而導(dǎo)致產(chǎn)生大量的GSM被魚體吸收，使魚體產(chǎn)生較重土腥味。

目前認(rèn)為減少魚體土腥味的方法有兩種：第一種是將帶有土腥味的魚轉(zhuǎn)移至不含土腥味物質(zhì)的凈水中養(yǎng)殖[36,40]。朱健明等[36]研究表明將土腥異味較重的鰱在清水中凈化32 d可有效改善其體內(nèi)土腥味。大西洋鮭在凈水中養(yǎng)殖10 d，魚肉中的土腥味物質(zhì)含量顯著降低[40]。第二種方法是原位移除養(yǎng)殖水體中土腥味物質(zhì)[36,40]。有研究表明[41]，枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的益生菌，能有效降解GSM和2-MIB。另外，枯草芽孢桿菌能有效降低水體中的氨氮、硝氮、亞硝氮濃度以及水體pH，其胞外酶還能分解水體和底泥中的有機(jī)質(zhì)，具有水質(zhì)凈化作用[41-42]。因此，對(duì)于本文中自然水庫網(wǎng)箱養(yǎng)殖的鮭科魚，可以采用凈水養(yǎng)殖方式減少魚體土腥味。對(duì)于循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖的鮭科魚，可以在生物過濾器上接種一些GSM和2-MIB降解菌，以改善水質(zhì)同時(shí)去除水體中GSM和2-MIB。

4 結(jié)語

MIB和GSM在虹鱒魚體內(nèi)的富集程度與魚體自身?xiàng)l件有關(guān)，虹鱒規(guī)格越大，脂含量越高，土腥味越嚴(yán)重。MIB和GSM在虹鱒不同組織內(nèi)的含量為肝臟>背肌>魚皮。水溫和pH是影響虹鱒體內(nèi)MIB產(chǎn)生的主要環(huán)境因子，氨氮和磷是影響虹鱒體內(nèi)GSM含量的主要環(huán)境因子。對(duì)于本文中鮭科魚的土腥味問題，可以采用凈水養(yǎng)殖和添加能降解土腥味物質(zhì)的益生菌兩種方法解決。