王錄軍,王韋華

(渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 陜西 渭南 714000 )

Ⅰ型耐熱腸毒素(Heat-stable toxin type I，STa)是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)引起人和動(dòng)物腹瀉產(chǎn)生的兩類主要腸毒素之一[1]。STa毒素是由18(豬源)或19(人源)個(gè)氨基酸組成的短肽[2, 3]。它們?cè)诎被嵝蛄泻蜕飳W(xué)活性上具有相似性。但是由于STa毒素的分子量小，只有與載體蛋白偶聯(lián)才具有免疫原性。STa基因在從幼齡動(dòng)物、兒童和旅行者腹瀉者分離的ETEC菌株中普遍攜帶[4, 5]。

雖然酶聯(lián)免疫技術(shù)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是檢測ETEC疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗STa抗體的簡單、快速和準(zhǔn)確的方法，但是該方法的應(yīng)用仍然面臨一些問題。STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物是目前應(yīng)用于ELISA檢測STa抗體唯一的包被抗原[6, 7]。化學(xué)偶聯(lián)的過程中要求純化的STa毒素，但是純化僅具有18或19個(gè)氨基酸的STa短肽，目前的技術(shù)還不成熟。雖然目前有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室具備純化具有生物活性的STa純毒素的能力，但是通常產(chǎn)量低至每升生長培養(yǎng)基僅能純化0.5～1 mg的STa純毒素。另外，純化的STa毒素和卵清蛋白(ovalbumin)化學(xué)偶聯(lián)的效率也不高。這使STa-ovalbumin偶聯(lián)物的供應(yīng)量非常有限。因此，急需研發(fā)一種新的包被抗原替代目前應(yīng)用的STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

E. coli DH5α，E. coli BL21(DE3)和pET-28α質(zhì)粒均由渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。IPTG購于美國Sigma公司，IRDye標(biāo)記的羊抗兔IgG購于美國NE公司，抗STa的陽性血清系美國堪薩斯州立大學(xué)Ronald教授饋贈(zèng)，STa抗體陽性或陰性豬、兔和小鼠血清均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)

3個(gè)拷貝的人源的estA基因(編碼人源STa)利用重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension?PCR，SOE-PCR)分別嵌合至修飾的雞ovalbumin基因的N端、C端和中部。其中estA基因與ovalbumin基因N端、C端之間用GPVD接頭連接。構(gòu)建的3×STa-ovalbumin嵌合基因采用原核表達(dá)，純化后的融合蛋白進(jìn)一步用SDS-PAGE電泳分析；以兔STa陽性血清為一抗(1∶3 000)，IRDye標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶10 000)為二抗，進(jìn)行western Blot分析。

1.3 融合蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

先將3×STa-ovalbumin融合蛋白的氨基酸序列用Phyre2在線服務(wù)器對(duì)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，PDB文件采用PyMOL軟件對(duì)融合蛋白的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.4 最佳抗原包被劑量的優(yōu)化

用方陣滴定法確定最佳抗原包被劑量：橫列將融合蛋白抗原從每孔6.25 ng、12.5 ng、25 ng、50 ng或每孔10 ng STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物包被，豎排將血清按1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600和1∶51 200倍比稀釋?；靹蛴?7℃孵育1 h，用PBST洗滌3次；然后加用羊抗鼠IgG-HRP的二抗37℃孵育1 h。PBST洗滌3次后，每孔加入100μL的TMB室溫顯色30 min。在650 nm處以空白對(duì)照孔調(diào)零后讀取各孔的吸光值(OD值)。OD650值與包被為每孔10 ng STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物的讀值最為接近的確定為最佳包被劑量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 敏感性和特異性檢測

以每孔25 ng的融合蛋白劑量作為包被抗原，以豬抗STa抗體陽性血清連續(xù)倍比稀釋(1∶400至1∶51 200倍)作為檢測血清，采用間接ELISA方法檢測其對(duì)抗STa抗體的敏感性。85份豬、兔和小鼠的抗STa陽性或陰性血清用于融合蛋白對(duì)抗STa抗體的特異性檢測。所有血清樣品先用每孔10 ng STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物作為包被抗原進(jìn)行ELISA檢測，確診為抗STa陽性或陰性血清。當(dāng)OD650讀值減去空白對(duì)照孔讀值>0.3時(shí)，結(jié)果判定為陽性，讀值<0.3時(shí)，結(jié)果判定為陰性。試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)平行孔。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Student's t-test 軟件，當(dāng)p<0.05時(shí)，判定為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)

DNA測序結(jié)果確認(rèn)3×STa-ovalbumin嵌合基因中包含3個(gè)拷貝的STa基因和內(nèi)含子縮短的ovalbumin基因。3個(gè)STa基因分別位于ovalbumin基因的N端、C端和中間部位。融合蛋白以包涵體的形式表達(dá)，目的蛋白純化后純度超過90%，分子量大小約為40 KDa，與預(yù)期的大小一致；且能與兔抗STa陽性血清特異性反應(yīng) (圖1)。

圖1 3×STa-ovalbumin融合蛋白的Western blot分析

2.2 融合蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，在N、C端和中間部位分別插入1拷貝的STa后并未破壞Ovalbumin蛋白的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步的分析表明，3個(gè)拷貝的STa均位于融合蛋白的表面(圖2)。

圖2 3×STa-ovalbumin融合蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。白色標(biāo)記的為STa多肽。

2.3 融合蛋白的最佳包被劑量

依據(jù)試驗(yàn)中方陣ELISA測試結(jié)果表明，當(dāng)包被劑量為每孔50 ng時(shí)，檢測抗STa陽性血清的敏感度最高。而當(dāng)包被劑量為每孔25 ng時(shí)，其對(duì)STa抗體陽性血清的檢測靈敏度與每孔包被10ng STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物的敏感度相當(dāng)。所以每孔25 ng是3×STa-ovalbumin融合蛋白作為包被抗原檢測抗STa陽性血清的最佳包被劑量。

2.4 敏感性和特異性試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)選用每孔25 ng的融合蛋白作為包被抗原檢測STa抗體陽性血清時(shí)，其檢測血清的最高稀釋倍數(shù)為1∶51 200 (圖3)。與使用STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物作為包被抗原的ELISA檢測比較，融合蛋白作為包被抗原檢測的特異性為100% (表1)。

圖3 抗STa抗體的敏感性檢測

樣品名稱樣品總數(shù)STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物作為包被抗原檢測3×STa-ovalbumin融合蛋白作為包被抗原檢測陽性樣品數(shù)陰性樣品數(shù)陽性樣品數(shù)陰性樣品數(shù)STa陽性血清48480480STa陰性血清37037037

3 討論

評(píng)估ETEC疫苗有效性的最快速和可靠的方法是用ELISA方法檢測疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平[8]。但是，目前檢測機(jī)體的STa抗體水平仍面臨居多挑戰(zhàn)。STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物是當(dāng)前應(yīng)用ELISA方法檢測抗STa抗體反應(yīng)唯一使用的包被抗原[6, 7]。但是，STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物的制備程序復(fù)雜，而且產(chǎn)量低和不穩(wěn)定。因此，目前急需研發(fā)一種替代STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物的新的包被抗原。我們的研究數(shù)據(jù)表明，3×STa-ovalbumin融合蛋白可作為抗STa抗體ELISA檢測的包被抗原。

我們的試驗(yàn)證明，E. coli原核表達(dá)3×STa-ovalbumin融合蛋白產(chǎn)量高達(dá)40mg每升培養(yǎng)基，而且純度超過90%。與STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物的制備方法相比，融合蛋白的制備方法簡單、成本低，而且產(chǎn)量高。但是該融合蛋白的蛋白特性需進(jìn)一步研究。用ELISA方法檢測STa抗體時(shí)，用融合蛋白作為包被抗原與用STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物作為包被抗原具有相同的敏感性和特異性。但是，檢測的敏感性和特異性還需要更多的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，與STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物的生產(chǎn)相比，新的融合蛋白的生產(chǎn)更簡單、快速和成本低廉，而且作為包被抗原對(duì)STa抗體的檢測具有相同的效果。因此，我們的試驗(yàn)結(jié)果證明，新構(gòu)建的3×STa-ovalbumin融合蛋白可以替代STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物作為ELISA方法檢測STa抗體的包被抗原。