哈 瑞，李 剛，師志云，武 濤，趙志軍，賈 偉△

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川 750004；寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院：2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心； 3.預(yù)防保健科，寧夏銀川 750004;4.寧夏病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750004)

銅綠假單胞菌為條件致病菌，亦是醫(yī)院感染的主要病原菌之一[1]。亞胺培南屬于碳青霉烯類藥物中常用的一種，近年來(lái)，耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌引起的感染不斷增多，本研究初步對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行了探討，旨在為臨床合理使用抗菌藥物治療銅綠假單胞菌的感染提供較有價(jià)值的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株 隨機(jī)挑選寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2016年1月至2017年9月各類臨床標(biāo)本中分離的對(duì)亞胺培南耐藥的非重復(fù)銅綠假單胞菌80株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.2儀器與試劑 VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及其配套鑒定卡購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；K-B法藥敏紙片及分配器、M-H藥敏平板、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；PCR反應(yīng)試劑2×Power Taq PCR MasterMix購(gòu)自中國(guó)北京百泰克生物技術(shù)有限公司；DL2000 Marker購(gòu)自中國(guó)北京全式金生物技術(shù)有限公司；合成的引物購(gòu)自中國(guó)上海生物工程股份有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 保存菌株室溫復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種培養(yǎng)18～24 h，K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定其對(duì)抗菌藥物的敏感性。實(shí)驗(yàn)方法及藥敏結(jié)果判斷參照2016年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.3.2PCR引物設(shè)計(jì) 本次試驗(yàn)所要檢測(cè)的耐藥基因引物均參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[2-7]，所有PCR擴(kuò)增所需的引物都委托中國(guó)上海生物工程有限公司合成。見表1。

表1 靶基因的引物序列

1.3.3耐藥基因檢測(cè) 采用煮沸法提取模板DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)采用50 μL體系，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35 s，適宜溫度退火35 s，72 ℃延伸1 min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用含GoldViewⅠ型核酸染色劑的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析(電壓80 V，時(shí)間35 min)，凝膠成像。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用WHONET5.6軟件進(jìn)行耐藥性分析。

2 結(jié) 果

2.1臨床特征 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌的科室分布以神經(jīng)外科(28.0%)、ICU(16.0%)、呼吸內(nèi)科(15.0%)所占比例較高。標(biāo)本類型以呼吸道標(biāo)本為主，占86.0%。見表2、3。

表2 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌主要科室分布

表3 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌的標(biāo)本分布

2.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌對(duì)阿米卡星的耐藥率最低(7.5%)，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率最高(97.5%)。見表4。

表4 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果(%)

續(xù)表4 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.3耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌中，blaVIM基因陽(yáng)性1株(1.2%)，blaOXA-10基因陽(yáng)性4株(5.0%)，其他耐藥基因均未檢出。膜孔蛋白OprD2缺失67株(83.8%)。見表5、圖1。

表5 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

注：M表示DNA標(biāo)準(zhǔn)帶；1表示blaVIM基因的擴(kuò)增條帶；2表示blaOXA-10基因的擴(kuò)增條帶；3表示膜孔蛋白OprD2基因的擴(kuò)增條帶；4表示膜孔蛋白OprD2基因缺失；5表示空白對(duì)照
圖1耐藥基因PCR結(jié)果

3 討 論

亞胺培南等碳青霉烯類抗菌藥物是對(duì)多種β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定的、非典型的一類β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，具有強(qiáng)大的殺菌活性，常作為治療銅綠假單胞菌感染的最后防線。然而近年來(lái)隨著此類抗菌藥物的不規(guī)范使用，耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌不斷增多，且呈現(xiàn)一定比例的多重耐藥性[8]，給臨床治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

銅綠假單胞菌的醫(yī)院科室分布廣泛，而且具有集中于部分科室的趨勢(shì)，該院以神經(jīng)外科(28.0%)、ICU(16.0%)送檢標(biāo)本的耐亞胺培南銅綠假單胞菌檢出率較高，有別于巫俊琴等[9]報(bào)道的呼吸內(nèi)科檢出率最高，可能因?yàn)樵撛哼@2個(gè)科室標(biāo)本送檢率高，患者住院時(shí)間長(zhǎng)，病情危重且抵抗力低下，較多呈昏迷狀態(tài)，常需使用器械性和侵入性治療手段維持生命體征。80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌主要分離自呼吸道標(biāo)本(86.0%)，與陳燕等[10]、張曉蘭等[11]的報(bào)道基本一致，呼吸道本身有定植銅綠假單胞菌，而住院患者呼吸道分泌功能減退，纖毛活動(dòng)減弱，分泌物增加，機(jī)體免疫力降低，更容易受銅綠假單胞菌侵襲，這二者共同導(dǎo)致呼吸道標(biāo)本中銅綠假單胞菌檢出率較高。

本研究藥敏結(jié)果顯示，耐亞胺培南銅綠假單胞菌對(duì)阿米卡星的耐藥率最低，為7.5%，與2017年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)道基本一致[12]。對(duì)其他兩種氨基糖苷類藥物妥布霉素和慶大霉素的耐藥率也較低，可能是因?yàn)槠渚哂卸拘院湍I毒性，而且單獨(dú)用于治療銅綠假單胞菌感染往往失敗，故臨床一般不單獨(dú)使用；對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑及氨曲南耐藥性較強(qiáng)，耐藥率分別為97.5%、48.7%，高于巫俊琴等[9]報(bào)道的67.0%和26.0%，可能與該院臨床較多使用此類藥物有關(guān)；對(duì)常用的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物哌拉西林、頭孢他啶、頭孢吡肟的耐藥率分別為22.5%、26.2%、21.2%，與高世華等[13]所報(bào)道的較一致，說(shuō)明該院對(duì)常規(guī)使用的抗菌藥物敏感性較好，可能與該院臨床醫(yī)師規(guī)范使用抗菌藥物，醫(yī)院嚴(yán)格進(jìn)行藥物監(jiān)管措施等有關(guān)。該院耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌呈現(xiàn)一定的多重耐藥，但程度相對(duì)較輕，建議治療此類細(xì)菌感染考慮聯(lián)合用藥，如β-內(nèi)酰胺類+氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類+喹諾酮類、喹諾酮類+氨基糖苷類或雙β-內(nèi)酰胺類?；诒狙芯康慕Y(jié)果，頭孢吡肟聯(lián)合阿米卡星可以用于絕大多數(shù)銅綠假單胞菌感染的治療。

銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，主要包括：(1)碳青霉烯酶的產(chǎn)生，能水解碳青霉烯類藥物，導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥[14]。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的主要碳青霉烯酶是B類金屬酶(MBL)及D類苯唑西林水解酶(OXA類酶)。目前在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的MBL主要有6種基因型：blaIMP、blaVIM、blaNDM-1、blaSIM、blaSPM、blaGIM，OXA類酶基因主要包括blaOXA-10、blaOXA-14、blaOXA-23等。該院耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌中，blaVIM基因陽(yáng)性1株(1.2%)，blaOXA-10基因陽(yáng)性4株(5.0%)，其他耐藥基因均未檢出，提示產(chǎn)生碳青霉烯酶不是本地區(qū)銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的主要機(jī)制。(2)外膜通透性障礙，膜孔蛋白OprD的改變或缺失，使抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌受阻而產(chǎn)生耐藥。OprD分為OprD1、OprD2、OprD3[15]，其中OprD2孔道具有配體特異性，能形成亞胺培南的特異性結(jié)合位點(diǎn)，為亞胺培南進(jìn)入細(xì)菌的的快速特異性通道[5],膜孔蛋白OprD2的缺失或表達(dá)降低是銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的重要機(jī)制。沈繼錄等[16]發(fā)現(xiàn)亞胺培南耐藥株的OprD2基因缺失率明顯高于敏感株。本研究中，膜孔蛋白OprD2基因缺失率為83.8%，表明膜孔蛋白OprD2基因缺失是導(dǎo)致該院銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的主要原因，與胡琴等[17]報(bào)道的72.0%較為一致，低于四川地區(qū)報(bào)道的100.0%[15]，國(guó)外ARABESTANI等[18]也有報(bào)道耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌中OprD2基因呈高表達(dá)，說(shuō)明銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制存在地域差異，而且各地區(qū)耐藥的主要原因也不盡相同。根據(jù)本研究中的耐藥性統(tǒng)計(jì)分析，該院耐亞胺培南銅綠假單胞菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥不甚嚴(yán)重，推斷膜孔蛋白OprD2缺失主要介導(dǎo)銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥，對(duì)其他藥物的作用較小。本研究中，80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌中，有72株檢測(cè)到碳青霉烯酶基因blaVIM、blaOXA-10，或者有膜孔蛋白OprD2基因的缺失，剩余8株耐藥菌可能由其他耐藥機(jī)制介導(dǎo)，銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制還有主動(dòng)外排泵的過(guò)度表達(dá)、藥物作用靶位的改變、細(xì)菌生物膜的形成以及整合子的介導(dǎo)等，筆者會(huì)在后續(xù)研究中進(jìn)一步闡明。

4 結(jié) 論

銅綠假單胞菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，因此，臨床醫(yī)師應(yīng)積極送檢微生物標(biāo)本，嚴(yán)格參考藥敏結(jié)果，合理選用抗菌藥物，以減少細(xì)菌耐藥的發(fā)生。該院銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的主要機(jī)制是膜孔蛋白OprD2的缺失，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)重視此類蛋白的流行病學(xué)檢測(cè)，加強(qiáng)醫(yī)院感染控制。