付 蘇，蔣 艷，樊朝鳳，段麗娟

(四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川成都 610041)

人腦膠質(zhì)瘤是臨床上較為嚴(yán)重的疾病，其惡性程度較高，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。全球每年約有18.9萬新發(fā)患者，并有14.2萬患者死亡，嚴(yán)重影響人類的健康[1-2]。為了改善患者預(yù)后，提高生存率，盡早診斷并給予有效治療就顯得尤為重要。因此，探索更多與患者臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義。有研究結(jié)果顯示，Six1在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，能夠促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。Six1蛋白是屬于Six同源盒基因家族的成員之一，作為轉(zhuǎn)錄因子，不僅能夠參與胚胎細(xì)胞的發(fā)育，還能夠調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的啟動(dòng)與轉(zhuǎn)移[4]。有研究表明，異黏蛋白(MTDH)在直腸癌組織中表達(dá)高于正常，并與腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。MTDH屬于星型細(xì)胞上調(diào)基因-1的表達(dá)產(chǎn)物，是一種胞質(zhì)蛋白，主要分布核周胞質(zhì)，近年發(fā)現(xiàn)MTDH與多種腫瘤的形成、侵蝕、發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。目前，人腦膠質(zhì)瘤的形成與發(fā)展仍需進(jìn)一步研究。因此，本次研究主要是采用免疫組化法檢測(cè)150例人腦膠質(zhì)瘤中Six1、MTDH的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2012年12月至2016年12月收治的150例腦膠質(zhì)瘤患者作為研究對(duì)象，并根據(jù)病理檢查與臨床資料將150例膠質(zhì)瘤組織作為研究組，同時(shí)選擇60例非腫瘤腦組織作為對(duì)照組。研究組男性78例，女性72例，年齡10～71歲，平均(52.21±5.50)歲。對(duì)照組男性32例，女性28例，年齡11～72歲，平均(53.22±5.47)歲。2組患者的年齡、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；并按照2007世界衛(wèi)生組織神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)診斷[8]分為Ⅰ級(jí)45例、Ⅱ級(jí)40例、Ⅲ級(jí)33例、Ⅳ級(jí)32例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合膠質(zhì)瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)無肥胖以及糖尿病代謝者；(3)獲得患者及家屬的知情同意，并簽署知情同意書；(4)術(shù)后早期復(fù)查，已證實(shí)腫瘤全切或次全切；(5)術(shù)前未進(jìn)行放療、化療治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤、嚴(yán)重器官疾病者；(2)嚴(yán)重肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病者；(3)術(shù)后再次手術(shù)、未順從隨訪者；(4)既往精神病史者。本次研究已獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 兔抗人Six1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鼠抗人MTDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abnova公司；免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自中國(guó)福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2.2采用免疫組化法檢測(cè)Six1、MTDH蛋白表達(dá) 采用免疫組化法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，使用10%福爾馬林將標(biāo)本常規(guī)固定，石蠟包埋，切片后進(jìn)行脫水，使用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶時(shí)間30 min，再使用乙二胺四乙酸高壓抗原修復(fù)，封閉30 min，加入稀釋濃度為1∶500的一抗，4 ℃孵育過夜。再分別加入二抗，孵育25 min，最后使用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來水返藍(lán)，蒸餾水洗滌，脫水、透明封片。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白組對(duì)照。

1.2.3結(jié)果判定[10]每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，并根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行判斷，采用染色指數(shù)反映目的蛋白的表達(dá)水平。(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度：無著色為0分；黃色為1分；棕色為2分；棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比：<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。(3)染色指數(shù)=將陽(yáng)性細(xì)胞百分比例與著色強(qiáng)度評(píng)分相乘判斷結(jié)果，具體標(biāo)準(zhǔn)為：0分為陰性表達(dá)(-)，≥1分均為陽(yáng)性表達(dá)，1～2分為低表達(dá)(+)，3～4分為中表達(dá)(++)，6～9分為高表達(dá)(+++)。免疫結(jié)果由高年資的病理醫(yī)師共同完成。

1.3隨訪 采用電話或者上門進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為確定病理日開始至2018年12月30日截止，每3個(gè)月隨訪一次，隨訪時(shí)間為3-72個(gè)月，以患者發(fā)生轉(zhuǎn)移或死亡為終點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.12組Six1、MTDH蛋白表達(dá)水平比較 研究組Six1、MTDH蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為65.33%(98/150)、63.33%(95/150)，對(duì)照組Six1、MTDH蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為33.33%(20/60)、28.33%(17/60)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

2.2腦膠質(zhì)瘤Six1、MTDH蛋白表達(dá)和臨床病理特征的比較 Six1、MTDH蛋白表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別、病理類型、病理學(xué)分級(jí)以及腫瘤直徑之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與腦膠質(zhì)瘤患者的分化程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且當(dāng)腫瘤分化程度越低時(shí)，Six1、MTDH蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高(P<0.05)。見表2。

2.3腦膠質(zhì)瘤中Six1、MTDH蛋白表達(dá)的相關(guān)性 采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法分析蛋白表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示在腦膠質(zhì)瘤患者中Six1、MTDH蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.354，P<0.05)。

表1 2組腦膠質(zhì)瘤Six1、MTDH蛋白表達(dá)水平比較[n(%)]

表2 腦膠質(zhì)瘤患者Six1、MTDH蛋白表達(dá)與臨床病理特征的比較

2.4腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后生存情況 所有研究對(duì)象在病理確診開始至隨訪結(jié)束存活3-72個(gè)月。腦膠質(zhì)瘤患者平均中位生存期36個(gè)月，其中Six1陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)患者的中位生存期分別為21個(gè)月、44個(gè)月，中位生存期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.872，P<0.05)；MTDH陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)患者的中位生存期分別為19個(gè)月、45個(gè)月，中位生存期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.361，P<0.05)。見圖2、3。

2.5影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素分析 經(jīng)單因素分析得出：病理學(xué)分級(jí)越高、腫瘤低分化、Six1陽(yáng)性、MTDH陽(yáng)性表達(dá)的患者其生存時(shí)間均明顯縮短(P<0.05)。見表3。

注：A表示Six1在非腫瘤腦組織中陰性表達(dá)；B表示MTDH在非腫瘤腦組織中陰性表達(dá)；C表示Six1在腦膠質(zhì)瘤組織中弱表達(dá)；D表示MTDH在腦膠質(zhì)瘤組織中弱表達(dá)；E表示Six1在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)；F表示MTDH在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)
圖1免疫組化染色檢測(cè)Six1和MTDH在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(×400)

圖2 不同Six1表達(dá)水平腦膠質(zhì)瘤患者生存曲線比較

2.6影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后Cox多因素分析 經(jīng)多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析得出：腫瘤低分化、Six1陽(yáng)性、MTDH陽(yáng)性表達(dá)均為影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

圖3 不同MTDH表達(dá)水平腦膠質(zhì)瘤患者生存曲線比較

表3 影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素分析

表4 影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后Cox多因素分析

3 討 論

人腦膠質(zhì)瘤是臨床上常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有較高的致死率，預(yù)后較差。目前臨床上對(duì)于人腦膠質(zhì)瘤主要采取手術(shù)聯(lián)合放療及化療等綜合治療方式，雖能夠改善患者臨床癥狀，但預(yù)后效果仍無法得到保障。但有研究發(fā)現(xiàn)，人腦膠質(zhì)瘤中的蛋白表達(dá)能夠反應(yīng)出腫瘤嚴(yán)重程度[11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，Six1在多種腫瘤中的表達(dá)水平升高，且與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后有著重要關(guān)系[12]。廖粵軍等[13]通過研究MTDH在腫瘤中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)MTDH隨著腫瘤逐漸嚴(yán)重其表達(dá)水平呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。說明MTDH在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中具有重要意義。本次研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)150例人腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)以及不同病理特征以及預(yù)后的相關(guān)性。

結(jié)果顯示，Six1、MTDH蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在人腦膠質(zhì)瘤組織中明顯升高，并與腦膠質(zhì)瘤的分化程度顯著相關(guān)(P<0.05)，且隨著腫瘤分化程度逐漸嚴(yán)重，Six1、MTDH陽(yáng)性表達(dá)率越高(P<0.05)，表明Six1、MTDH表達(dá)與腫瘤等級(jí)呈正相關(guān)，能夠反應(yīng)疾病的嚴(yán)重程度。本次研究運(yùn)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法，結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤患者中Six1、MTDH蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.354，P<0.05)，由此可見，Six1、MTDH具有較強(qiáng)的相關(guān)性。在人腦膠質(zhì)瘤中Six1、MTDH陽(yáng)性表達(dá)的中位生存時(shí)間均縮短，并與腫瘤的分化程度密切相關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)，本次研究還運(yùn)用了Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，結(jié)果顯示，腫瘤低分化、Six1、MTDH陽(yáng)性表達(dá)均為影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，表示Six1、MTDH表達(dá)能夠反應(yīng)人腦膠質(zhì)瘤的嚴(yán)重程度，可作為評(píng)估患者預(yù)后的有效指標(biāo)。

Six家族主要是由Six1/Six2、Six3/Six6、Six4/Six5亞家族組成[14]。其中Six1作為同源盒基因成員之一，產(chǎn)物蛋白是由高度保守的同源異型結(jié)構(gòu)域的N-末端以及Six結(jié)構(gòu)域組成[15]，基因主要定位于人染色體14q23上，能夠特異性的調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，不僅能夠影響組織細(xì)胞的發(fā)育，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等方面均有著重要的作用[16]。同時(shí)近來研究發(fā)現(xiàn)，Six蛋白在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、侵蝕以及轉(zhuǎn)移，對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著重要的意義[17]。MTDH屬于星型細(xì)胞上調(diào)基因-1的表達(dá)產(chǎn)物，是一種極其保守的蛋白，其蛋白基因主要定位于8q22上，并具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄子，其跨膜區(qū)在432至451氨基酸以及561至580氨基酸之間，存在與核定位信號(hào)相關(guān)的賴氨酸[18-19]。并發(fā)現(xiàn)MTDH與多種腫瘤的發(fā)展、增殖、侵蝕、轉(zhuǎn)移相關(guān)[20]。但本組研究選取樣本量較少和研究時(shí)間過短，更多研究結(jié)果，需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

Six1蛋白與MTDH蛋白在腦膠質(zhì)瘤患者組織中的表達(dá)水平升高，其表達(dá)水平隨著腦膠質(zhì)瘤惡性程度的升高而升高，Six1蛋白表達(dá)陽(yáng)性或MTDH蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者預(yù)后較差，生存時(shí)間明顯縮短。Six1蛋白與MTDH蛋白可作為判斷腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。