曹敬榮，王 巖，陳典典，段園園，閔 嶸，劉云屹，謝 威，王培昌

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗科，北京 100053)

血流感染是臨床上重癥感染性疾病之一，具有較高的發(fā)病率和病死率[1-2]。研究報道血培養(yǎng)陽性病原菌中絕大部分為兼性厭氧菌，專性厭氧菌的構(gòu)成比為1%～17%[3]。由于厭氧血培養(yǎng)瓶內(nèi)營養(yǎng)成分比需氧瓶好，資料顯示在血培養(yǎng)雙瓶報陽時厭氧瓶報陽時間(TTP)常早于需氧瓶，而且部分兼性厭氧菌只在厭氧血瓶內(nèi)生長[3]。因此，早期、準(zhǔn)確地鑒定陽性厭氧血培養(yǎng)瓶中細菌，提高兼性及專性厭氧菌的陽性檢出率，對臨床正確采取診療措施、降低治療費用、挽救患者生命等非常重要。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)已被報道用于直接鑒定血培養(yǎng)標(biāo)本中的病原菌，為臨床微生物檢驗提供了一種省時、有效的手段，因而成為研究熱點[4-10]。本研究應(yīng)用分離膠促凝管和0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)法聯(lián)合MALDI-TOF MS直接鑒定陽性厭氧血培養(yǎng)瓶中細菌，并與傳統(tǒng)陽性血培養(yǎng)鑒定方法比較，分析MALDI-TOF MS直接鑒定臨床厭氧血培養(yǎng)陽性菌的可行性和準(zhǔn)確性，評價不同前處理方法用于質(zhì)譜快速鑒定的臨床應(yīng)用價值，為臨床早期、快速、準(zhǔn)確診治血流感染提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本收集 收集2017年8月至2018年8月首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院微生物室非重復(fù)的陽性厭氧血培養(yǎng)瓶240瓶，經(jīng)革蘭染色鏡檢有菌生長。剔除標(biāo)準(zhǔn)為血培養(yǎng)報警陽性后涂片鏡檢未見到可疑菌(假陽性)。

1.2試劑與儀器 全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)及其配套的含溶血素厭氧血培養(yǎng)瓶，分離膠促凝管購自美國BD公司，型號FX400；甲酸、乙腈、三氟乙酸購自美國Sigma Aldrich公司；IVD細菌測試標(biāo)準(zhǔn)品、基質(zhì)(HCCA)、96孔金屬靶板和Biotyper3.1鑒定分析軟件及質(zhì)譜儀均購自德國Bruker公司；血瓊脂平板和厭氧血平板購自英國OXOID公司；SDS購自美國Sigma公司；厭氧產(chǎn)氣袋購自法國Biomerieux公司。

1.3方法

1.3.1陽性血培養(yǎng)涂片鏡檢及轉(zhuǎn)種后MALDI-TOF MS鑒定 血培養(yǎng)報陽后查看生長曲線和TTP，即刻完成對陽性培養(yǎng)液的染色鏡檢，初步確定血培養(yǎng)瓶中待測菌種類。同時轉(zhuǎn)種普通血平板和厭氧血平板(厭氧袋培養(yǎng))，分別在需氧和厭氧環(huán)境37 ℃培養(yǎng)24～48 h至生長單個菌落。以1 μL加樣槍頭挑取單個菌落點靶，室溫干燥后加入70%甲酸1 μL，室溫干燥后加入1 μL基質(zhì)溶液覆蓋，室溫晾干后將靶板放到質(zhì)譜儀，應(yīng)用Biotyper3.1軟件鑒定。質(zhì)譜鑒定參數(shù)為線性、正離子、蛋白峰峰譜范圍2 000～20 000 m/z，激光解吸每孔240次。

1.3.2分離膠促凝管法和0.5% SDS法MALDI-TOF MS直接鑒定 將涂片鏡檢陽性的血培養(yǎng)瓶混勻后，根據(jù)文獻[7-10]中分離膠法和SDS法處理流程，富集獲得陽性厭氧血培養(yǎng)瓶中的細菌沉淀。分離膠法和SDS法前處理流程：用無菌注射器抽取陽性厭氧血培養(yǎng)瓶內(nèi)溶液4 mL至分離膠促凝管或4 mL含0.5%SDS的離心管，室溫下4 000 r/min離心5 min棄上清。分離膠上層邊緣的灰白色沉淀或SDS離心后的沉淀中加入無菌水1 mL混勻后移至1.5 mL小型離心管，12 000 r/min離心2 min，棄上清，重復(fù)洗滌2次至清亮。沉淀加入300 μL無菌生理鹽水和900 μL無水乙醇混勻，12 000 r/min離心2 min后棄上清。加入50 μL 70%甲酸和50 μL乙腈混勻后13 000 r/min離心2 min，取上清(菌體蛋白)1 μL點靶，進行質(zhì)譜鑒定。每1標(biāo)本涂抹2個靶位，鑒定結(jié)果不一致時重復(fù)1次記錄結(jié)果。

1.3.3質(zhì)譜鑒定評分標(biāo)準(zhǔn) 鑒定結(jié)果包括鑒定到種或?qū)?、鑒定出兩種或兩種以上菌、頻譜錯誤、無鑒定結(jié)果、譜峰不足等情況。本研究參考文獻自建了MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)[10]：分值>2.0或1.7～2.0且均為同種菌記錄為種水平；分值1.7～2.0或≥1.6且有兩種以上菌記錄為屬水平；分值<1.6或存在多種不同菌記錄為無法準(zhǔn)確鑒定。

2 結(jié) 果

2.1厭氧血培養(yǎng)的TTP 共收集陽性厭氧血培養(yǎng)瓶240瓶，患者年齡17～95歲，平均(60.11±17.93)歲，男性138例，女性102例；主要分布在急診科(24.17%，58/240)、普外ICU(16.67%，40/240)、普外科(7.92%，19/240)、神經(jīng)內(nèi)科(6.25%，15/240)和骨科病房(5.42%，13/240)。240瓶陽性厭氧血培養(yǎng)瓶包括單一菌陽性234瓶，混合菌生長6瓶，TTP為3.34～114.40 h，平均TTP為(16.87±13.12)h，其中革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的平均TTP分別為(22.05±14.11)h和(14.00±11.43)h，混合菌的平均TTP為(12.42±1.69)h。

2.2分離膠促凝管法和0.5% SDS法MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果 218瓶(90.83%)厭氧血培養(yǎng)瓶中細菌可用MALDI-TOF MS直接鑒定，4瓶(1.67%)混合菌生長無可靠鑒定結(jié)果。SDS法前處理鑒定的準(zhǔn)確率(94.17%，226/240)高于分離膠法(90.83%，218/240)，兩種前處理方法對革蘭陰性菌的鑒定準(zhǔn)確率(94.81%，146/154和94.16%，145/154)顯著高于革蘭陽性菌(87.5%，70/80和81.25%，65/80)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.96、9.53，P<0.05)；SDS法和分離膠法單一菌質(zhì)譜鑒定與菌落鑒定結(jié)果的一致率分別為92.31%(216/234)和89.74%(210/234)。分離膠法和SDS法直接鑒定革蘭陰性桿菌和革蘭陽性菌的準(zhǔn)確率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；分離膠法和SDS法均可鑒定厭氧菌(脆弱/多形擬桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌等)。見表1。

表1 分離膠促凝管法和0.5% SDS法單一菌MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果[n(%)]

2.3兩種前處理方法的鑒定分值 分離膠法和SDS法鑒定分值>2.0分者分別占65.81%和69.23%，1.6～2.0分者分別占23.93%和23.08%，<1.6分及錯誤鑒定者分別占10.26%和7.69%。SDS法鑒定革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和厭氧菌得分>2.0的比率均高于分離膠法(62.50%，71.83%，83.33%；60.00%，69.72%，58.33%)；1.6～2.0分時分離膠法鑒定革蘭陰性菌和厭氧菌高于SDS法(23.94%，41.67%；22.54%，16.67%)。見表2。

2.4混合菌的鑒定 本研究共有6瓶陽性瓶為復(fù)合菌，分別為金黃色葡萄球菌+屎腸球菌、大腸埃希菌+屎腸球菌、弗勞地枸櫞酸桿菌+屎腸球菌、肺炎克雷伯菌+陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌+糞腸球菌、肺炎克雷伯菌+乳酸乳球菌。其中，分離膠法鑒定出2瓶混合菌，3瓶僅檢出了其中一種菌，1瓶無可靠鑒定結(jié)果；SDS法鑒定出3瓶復(fù)數(shù)菌，3瓶僅鑒定出其中一種菌。見表3。

表2 分離膠促凝管法和0.5% SDS法單一菌MALDI-TOF MS鑒定分值[n(%)]

表3 分離膠促凝管法和0.5% SDS法MALDI-TOF MS鑒定混合菌結(jié)果

3 討 論

目前，國內(nèi)外已有較多報道利用MALDI-TOF MS直接鑒定陽性血培養(yǎng)瓶中微生物的方法，富集菌的前處理方法包括分離膠促凝管法、皂素法、SDS法、預(yù)培養(yǎng)后鑒定商品化方法，各種方法均有各自特點和較好的鑒定結(jié)果[4-15]。亦有利用質(zhì)譜技術(shù)進行厭氧菌鑒定的文獻報道和評估MALDI-TOF MS鑒定靈敏度的報道(可檢測100 CFU/mL)[16-18]。血流感染診治的關(guān)鍵是早期準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷，文獻報道厭氧血培養(yǎng)瓶的TTP多早于需氧瓶，且大部分血流感染病原菌為兼性厭氧菌，且厭氧菌引起血流感染有增加趨勢，但由于厭氧菌生長緩慢且生長條件苛刻，傳統(tǒng)的生化鑒定易出錯或鑒定率低，鑒定時間長，結(jié)果不可靠[3]。因此，快速鑒定陽性厭氧血瓶中微生物，對臨床早期的抗菌藥物治療有較大意義。而MALDI-TOF MS在快速鑒定病原菌方面體現(xiàn)了很大的優(yōu)勢，能顯著縮短鑒定時間，本研究在涂片鏡檢確定有菌基礎(chǔ)上應(yīng)用分離膠法和0.5%SDS前處理方法進行質(zhì)譜的直接鑒定，并參照之前報道自建了質(zhì)譜鑒定評分，分析MALDI-TOF MS直接鑒定臨床厭氧血培養(yǎng)陽性菌的可行性和準(zhǔn)確性，為臨床對癥治療提供依據(jù)。

本研究共收集陽性厭氧血培養(yǎng)瓶240瓶，通過分析TTP可見，厭氧血培養(yǎng)瓶的TTP最短為3.34 h，最長為114.40 h，平均TTP為(16.87±13.12) h；革蘭陰性菌(14.00±11.43) h和混合菌(12.42±1.69)h的平均TTP明顯短于革蘭陽性菌(22.05±14.11)h，與文獻報道一致[1,3]。由此可見，利用質(zhì)譜直接鑒定可顯著縮短報告時間，在報陽后2 h左右即可為臨床提供初步鑒定結(jié)果，為臨床及時抗感染治療爭取寶貴時間。本研究通過兩種不同預(yù)處理方法結(jié)合MALDI-TOF MS直接鑒定結(jié)果顯示分離膠法和SDS法與純培養(yǎng)鑒定的符合率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，均可用于陽性厭氧瓶中微生物的直接鑒定。分離膠法和SDS法在鑒定革蘭陰性桿菌顯示了較高的準(zhǔn)確率(>94%)，且對臨床常見革蘭陰性細菌可準(zhǔn)確鑒定到種，顯示該兩種方法對于革蘭陰性菌引起的敗血癥有更高的可信度，臨床可根據(jù)血培養(yǎng)直接鑒定結(jié)果，結(jié)合本機構(gòu)的耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)，及時給予患者針對性治療可大大減少危重患者的病死率。對厭氧菌的鑒定，兩種前處理方法均可鑒定，且SDS法的鑒定準(zhǔn)確率(>2.0分)明顯高于分離膠法，提示采用0.5% SDS法對標(biāo)本進行預(yù)處理，可達到更高的檢出率和更佳的鑒定結(jié)果，與文獻報道一致[7,10]。革蘭陽性菌的鑒定中SDS法(87.50%)前處理的檢出率略高于分離膠法(81.25%)，二者均可用于陽性血培養(yǎng)瓶的直接鑒定，對金黃色葡萄球菌的鑒定有較好結(jié)果(100.00%)，而鑒定其他葡萄球菌屬(表皮葡萄球菌、人葡萄球菌和溶血葡萄球菌等)的準(zhǔn)確率相對較低，可能與其細胞壁中肽聚糖含量多而厚難以裂解出蛋白、以及某些殘留的血液蛋白可能干擾質(zhì)譜峰有關(guān)；鑒定鏈球菌的準(zhǔn)確率，SDS法較分離膠法鑒定率明顯增高(P<0.05)，但兩種前處理方法均未得到較好的鑒定結(jié)果(33%～66%)，可能與鏈球菌各菌種之間表型及蛋白相似性較高及質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫圖譜相對不足有關(guān)，與之前文獻報道相似，用純菌落鑒定有時亦難以區(qū)分(如肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌等)，需加做試驗進行確認[1,8,10]。另外，研究顯示質(zhì)譜對混合感染樣本的直接檢測，有2瓶分別經(jīng)SDS法和分離膠法處理后質(zhì)譜直接鑒定(金黃色葡萄球菌+屎腸球菌和肺炎克雷伯菌+糞腸球菌)，分離膠法有3瓶僅檢出了其中一種菌，1瓶無確切鑒定結(jié)果，SDS法亦有3瓶僅檢出一種菌，與以往文獻的報道類似，可能與兩種菌在血培養(yǎng)瓶中的不同比例混合有關(guān)[7,19]。文獻認為多種菌不同比例混合時質(zhì)譜能同時檢測到兩種菌(1∶1或1∶2)或只有優(yōu)勢菌被檢出(1∶9比例混合)或無法準(zhǔn)確鑒定(同一數(shù)量級的多種細菌可互相干擾質(zhì)譜峰圖)[19]。本研究中復(fù)數(shù)菌的例數(shù)和混合菌種類型較少(6例)，還需更多的研究數(shù)據(jù)來證明或使用模擬標(biāo)本來驗證。

4 結(jié) 論

本研究利用分離膠促凝管法和0.5% SDS前處理方法聯(lián)合MALDI-TOF MS鑒定陽性厭氧血培養(yǎng)瓶中的常見菌和厭氧菌，具有快速準(zhǔn)確、成本低廉、可行性高的特點，是實驗室鑒定陽性血培養(yǎng)中病原菌的一個早期可行的檢測手段，SDS前處理法較分離膠法對厭氧菌的鑒定有更高的準(zhǔn)確率，適合臨床微生物實驗室作為難鑒定或重癥患者快速鑒定的應(yīng)用。