李聰，劉健慧，李志輝，張敏，高浩，檀建新

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

近年來，食源性疾病屢見不鮮，其中主要的食源性致病菌有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和蠟樣芽孢桿菌等，可導(dǎo)致腹瀉、嘔吐、痢疾等多種疾病，嚴(yán)重者可造成死亡，因此，食品產(chǎn)品中要求不得檢出[1]。常規(guī)微生物學(xué)方法檢測食源性致病菌，通常需要經(jīng)過富集培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生理生化鑒定等的過程，耗時耗力，且主觀性強(qiáng)，極易導(dǎo)致樣品菌種的流失，出現(xiàn)陰性結(jié)果，不能及時的發(fā)現(xiàn)并控制潛在的危險[2-3]。目前新型的檢測方法熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（realtime polymerase chain reaction，PCR），靈敏度高，但極易因試驗(yàn)操作不當(dāng)出現(xiàn)假陽性，而且需要專業(yè)性強(qiáng)的工作人員和較為昂貴的儀器，用于多重檢測有一定難度。

而PCR 檢測法可以根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳觀察被檢的特異性片段長度大小來判斷，簡單易懂，耗時短。多重PCR 是在普通PCR 的基礎(chǔ)上，在同一PCR 體系中加入不同菌種特異性基因的特異性引物，擴(kuò)增多個模板的不同區(qū)域，得到相應(yīng)的不同片段長度，以此來檢測目標(biāo)菌的有無。因此可利用多重PCR 技術(shù)同時檢測食品中的多種病原菌，在短時間內(nèi)同步篩選多組樣品。多重PCR 省時省力，成本低，大大提高了工作效率[3]。多重PCR 技術(shù)檢測食源性致病菌已經(jīng)被逐漸應(yīng)用，如閔文光等利用三重PCR 的方法檢測志賀菌、副溶血性弧菌和大腸埃希菌O157[4]；姜華等利用多重PCR檢測嬰幼兒配方奶粉中3 種食源性致病菌[5]。本研究選用蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和沙門氏菌的6 個特異性基因，設(shè)計了12 對特異性引物，對其進(jìn)行篩選，優(yōu)化多重PCR 反應(yīng)條件，建立4 種食源性致病菌的多重PCR 快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

蠟樣芽孢桿菌（CMCC63302）、金黃色葡萄球菌（CMCC26003）、宋內(nèi)氏志賀氏菌（CMCC51334）、鼠傷寒沙門氏菌（CMCC50115）、大腸埃希氏菌（CMCC44752）、銅綠假單胞菌（CICC21636）、蘇云金芽孢桿菌（CICC22945）、綠膿桿菌（CMCC10110）、阪崎腸桿菌（ATCC51024）、副溶血性弧菌（CICC21617）、變形桿菌（CMCC49027）、單增李斯特菌（CMCC54001），均保存于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖：北京全式金生物公司；agar：索萊寶生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒：天根生化科技有限公司；2×Es Taq MasterMix（Dye）：康為世紀(jì)生物科技有限公司；50 bp DNA Ladder：中科瑞泰生物科技有限公司；ddH2O：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

MTH-012 型旋渦混合儀：海門其林貝爾儀器制造有限公司；070-851 型 PCR 儀：德國 Biometra 公司；DYY-10 C 型電泳儀：北京市六一儀器廠；JY04S-3E 型凝膠成像分析系統(tǒng)：北京科普爾科技發(fā)展有限公司；UV-1700 型紫外分光光度計：上海優(yōu)尼科公司；K5500型超微量核酸測量儀：北京凱奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

分別挑取蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌的單菌落，接種于8 mL 滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃搖床180 r/min 過夜培養(yǎng)。

1.3.2 模板的制備及計數(shù)

取1 mL 過夜培養(yǎng)菌液，提取基因組DNA 為模板，具體操作方法見細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書。用核酸測定儀對DNA 濃度及純度進(jìn)行測定。另取1 mL 菌液，10 倍梯度稀釋，涂布于固體肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，進(jìn)行平板計數(shù)。

1.3.3 引物的設(shè)計與合成

針對蠟樣芽孢桿菌的gyrB、nheA 基因[6-7]，金黃色色葡萄球菌的nuc、SED、MecA[8-10]基因、志賀氏菌的ipaH 基因[11-13]和沙門氏菌的 ttr、sal、SiiA 基因[14-16]，共設(shè)計了11 套引物，引物由上海生工公司合成，引物序列及擴(kuò)增片段長度等見表1。

1.3.4 引物的篩選和確定

以表1 中的11 對引物分別對4 種目的菌進(jìn)行擴(kuò)增，單一PCR 反應(yīng)體系為：2×Es Taq Master Mix（Dye）5 μL、20 μmol/L 上下游引物各 0.2 μL，DNA 模板0.8 μL，加 ddH2O 補(bǔ)足到 10 μL。單一 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，梯度設(shè)置退火溫度，退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，72 ℃再延伸 7 min，反應(yīng)30 個循環(huán)。對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，選擇擴(kuò)增條帶單一且大小不同、退火溫度相似的引物，確定為多重PCR 引物組。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

續(xù)表1 引物序列Continue table 1 Primer sequence

1.3.5 多重PCR 退火溫度的確定

用篩選得到的引物組，進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增。多重PCR 反應(yīng)體系為：2×Es Taq Master Mix（Dye）5 μL，20 μmol/L 上下游引物各 0.2 μL，DNA 模板各 0.8 μL，加 ddH2O 補(bǔ)足到 10 μL。多重 PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，梯度設(shè)置退火溫度，退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，72 ℃再延伸 7 min，反應(yīng) 30 個循環(huán)，對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，選擇條帶清晰的退火溫度，確定為多重PCR 退火溫度。

1.3.6 多重PCR 引物濃度的確定

在多重PCR 體系中，同時加入蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和沙門氏菌4 種目標(biāo)菌的引物，其起始引物濃度均為20 μmol/L，按照表2[17]對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，確定最佳引物加入量。

表2 引物的加入量Table 2 The addition amount of each pair of primer

續(xù)表2 引物的加入量Continue table 2 The addition amount of each pair of primer

1.3.7 多重PCR 特異性的鑒定

為驗(yàn)證引物組的特異性，以篩選出的引物分別對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌以及其他8 株非目的菌進(jìn)行擴(kuò)增（包括大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、綠膿桿菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、蘇云金芽孢桿菌）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系與程序同單重PCR，并對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3.8 多重PCR 靈敏度的分析

分別對已知濃度的蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌基因組DNA，用滅菌的ddH2O 進(jìn)行10 倍梯度稀釋，每個梯度各取0.8 μL 作為多重PCR反應(yīng)的模板，用本研究建立的多重PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR 產(chǎn)物，分析其靈敏度。

1.3.9 人工接種牛奶樣品多重PCR 靈敏度的驗(yàn)證

取過夜培養(yǎng)的4 種菌液各1 mL，10 倍梯度稀釋進(jìn)行菌落計數(shù)，另各取5 mL 接種于30 mL 滅菌的牛奶中，均質(zhì)后取4 mL 提取基因組DNA，10 倍梯度稀釋提取的基因組DNA，作為多重PCR 的模板，凝膠電泳觀測條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物的篩選

用表1 中的11 對引物，分別對蠟樣芽孢桿菌、金黃色色葡萄球菌、志賀氏菌和沙門氏菌進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖1～圖4 所示。

圖1 蠟樣芽胞桿菌特異性引物和擴(kuò)增溫度的篩選Fig.1 Screening of the specific primers and annealing temperature of Bacillus cereus

圖2 金黃色葡萄球菌特異性引物和擴(kuò)增溫度的篩選Fig.2 Screening of the specific primers and annealing temperature of Staphylococcus aureus

圖3 志賀氏菌特異性引物和擴(kuò)增溫度的篩選Fig.3 Screening of the specific primers and annealing temperature of Shigella

圖4 沙門氏菌特異性引物和擴(kuò)增溫度的篩選Fig.4 Screening of the specific primers and annealing temperature of Salmonella

由圖可知，蠟樣芽孢桿菌gyrB 引物對在52.5、55.7 ℃范圍內(nèi)條帶明顯，片段長246 bp；金黃色葡萄球菌nuc 引物對在52.5 ℃處有單一明亮條帶，片段長166 bp；志賀氏菌的ipaHⅠ引物對在52.6 ℃處單一明亮條帶，片段長210 bp，ipaH Ⅲ引物對在退火范圍內(nèi)條帶單一，片段長65 bp；沙門氏菌SiiA 引物對在梯度退火溫度下條帶單一明亮，片段長107 bp，退火溫度相近且擴(kuò)增出的片段長度不同，有利于多重PCR 擴(kuò)增結(jié)果的判斷，最終選擇 gyrB、nuc、ipaHⅢ、SiiA 引物對為多重PCR 反應(yīng)的引物組。

2.2 多重PCR的退火溫度的確定

以篩選所得的引物組，利用多重PCR 反應(yīng)體系，擴(kuò)增4 種菌的基因組DNA，因2.1 所選的引物在53 ℃左右有比較清晰的條帶，故設(shè)置50 ℃～57 ℃為多重PCR 的退火溫度梯度，結(jié)果見圖5。

圖5 多重PCR 退火溫度的篩選Fig.5 Optimization of annealing temperature of multiplex PCR

如圖5 所示，當(dāng)退火溫度在這個范圍內(nèi)間均能得到4 條目的帶，且條帶區(qū)間明顯，故證明本研究建立的多重PCR 體系，可特異性擴(kuò)增出目的條帶，且其大小與預(yù)期擴(kuò)增基因片段大小一致，但在53.9 ℃之前條帶略暗，退火溫度為53.9 ℃時條帶更加清晰明亮，因此，選定54 ℃作為多重PCR 的最適退火溫度。但多重PCR 擴(kuò)增的志賀氏菌65 bp 與金黃色葡萄球菌166 bp條帶相對暗一些，故對4 組引物對的加入量進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 多重PCR引物濃度的確定

用每一對引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增所得條帶都明亮清晰，但當(dāng)多對引物、多個模板同時在一個體系中時，條帶亮度分布不均，故對引物濃度加以優(yōu)化，結(jié)果見圖6。

圖6 多重PCR 引物加入量的優(yōu)化Fig.6 Optimization of primer addition of multiplex PCR

如圖6 所示，在第5 泳道，4 條目的條帶清晰明亮，且分布均勻，即蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和沙門氏菌的引物分別加入 0.2、0.2、0.4、0.1 μL。

2.4 多重PCR體系的特異性分析

蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌以及其他8 株非目的菌（包括大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、蘇云金芽孢桿菌、綠膿桿菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、變形桿菌、單增李斯特菌）為模板進(jìn)行擴(kuò)增，均未見條帶出現(xiàn)，故驗(yàn)證多重PCR 引物組有一定的特異性，能夠進(jìn)行4 種目標(biāo)菌的特異性分析。具體結(jié)果結(jié)果圖7。

圖7 多重PCR 特異性分析Fig.7 Specificity analysis of the multiplex PCR method

2.5 多重PCR靈敏度的鑒定

測得1mL 蠟樣芽孢桿菌的核酸濃度為52.649ng/μL，對應(yīng)菌落濃度為1.5×107CFU/mL；1mL 金黃色葡萄球菌的核酸濃度為14.245 ng/μL，對應(yīng)菌落濃度為108CFU/mL；1 mL 志賀氏菌的核酸濃度為357.78 ng/μL，對應(yīng)菌落濃度為108 CFU/mL；1 mL 沙門氏菌的核酸濃度為108.32 ng/μL，對應(yīng)菌落濃度為 1.05×108CFU/mL。用ddH2O 10 倍梯度稀釋提取的DNA 模板，取0.8 μL 進(jìn)行多重PCR，測定其檢出限，結(jié)果見圖8。

圖8 多重PCR 的靈敏度Fig.8 Sensitivity of multiplex PCR

如圖8 所示，在第5 泳道仍可見清晰條帶。最終得出多重PCR 對蠟樣芽孢桿菌的核酸濃度檢出限為4.21 pg，對應(yīng)菌落濃度為2×101CFU/mL；金黃色葡萄球菌的核酸濃度檢出限為1.14 pg，對應(yīng)菌落濃度檢出限為1.3×102CFU/mL；志賀氏菌的核酸濃度檢出限為28.62 pg，對應(yīng)菌落濃度為1.3×102CFU/mL；沙門氏菌的核酸濃度檢出限為8.67 pg，對應(yīng)菌落濃度為1.4×102CFU/mL。

2.6 多重PCR在牛奶中靈敏度的鑒定

取4 mL 牛奶提取基因組DNA，其核酸濃度為493.62 ng/μL，10 倍梯度稀釋 DNA，各取 3.2 μL 為模板進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，結(jié)果見圖9。

圖9 牛奶中多重PCR 的靈敏度Fig.9 Sensitivity of multiplex PCR for analysis of milk

如圖9 所示，擴(kuò)增的目的條帶分區(qū)明顯，在第4 泳道有清晰條帶?？傻迷谂Ｄ讨? 種菌的檢出限分別是：蠟樣芽孢桿菌2.35×102CFU/mL、金黃色葡萄球菌 3.72×103CFU/mL、志賀氏菌 4.2×103CFU/mL、沙門氏菌3.25×103CFU/mL。靈敏度相比于純菌的檢出限要低，可能是受牛奶中蛋白的影響，降低了基因組DNA 的提取效率。

3 討論

目前，普通PCR 技術(shù)在食品檢測、疾控檢測中，已經(jīng)相當(dāng)成熟，相對于傳統(tǒng)的生化特性檢測，有著快速、特異、靈敏度高的特點(diǎn)。在簡單的PCR 基礎(chǔ)上，多重PCR 融合了普通PCR 方便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，加入多個引物對，可進(jìn)行多個菌種多個樣品的快速分析[18]，簡單易操作，無需昂貴的儀器和專業(yè)的實(shí)驗(yàn)人員，也可進(jìn)行準(zhǔn)確的分析，為快速發(fā)展的食品檢測行業(yè)，提供了很好的理論和技術(shù)基礎(chǔ)[19]。由于多重PCR 是在同一反應(yīng)下進(jìn)行的，節(jié)約成本，因此相對于常規(guī)的單重PCR來說，大大縮短的檢測時間，提高了檢測效率[20-21]。食品檢測的快速發(fā)展，多重PCR 方法以其特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的快速檢測中[22]。

本試驗(yàn)以蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌為研究對象，探討應(yīng)用多重PCR 檢測食品中的致病菌。首先篩選退火溫度相似，擴(kuò)增片段區(qū)間不同的引物，最終得到適合多重PCR 的gyrB、nuc、ipaH III、SiiA4 個引物對，且特異性強(qiáng)。當(dāng)蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和沙門氏菌的引物（初始濃度均為 20 μmol/mL）分別加入 0.2、0.2、0.4、0.1 μL，退火溫度為54 ℃時，擴(kuò)增條帶更為明顯，作為多重PCR 的最適擴(kuò)增條件。人工污染牛奶，仍可見清晰條帶，故應(yīng)用于食品中的致病菌檢測是可行的。綜上，本研究建立的多重PCR 反應(yīng)系統(tǒng)具有良好的特異性和靈敏性，為食品中常見食源性致病菌的檢測提供試驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)方法。