石玉如，岳莉，姚余有，趙長城，谷妍，劉楊，王云，戚應(yīng)杰

（1.安徽省立醫(yī)院感染病院，安徽 合肥 230022；2.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）屬于黃病毒科肝炎病毒屬，是引起全球慢性丙型肝炎、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌的重要因素之一[1-2]。HCV 基因組為單股正鏈RNA，易變異，目前可分為7 種基因型及數(shù)十種不同的基因亞型[3]。據(jù)文獻(xiàn)報道，不同HCV 的基因分型在臨床診斷、治療和預(yù)后康復(fù)方面具有重要的意義[4-5]。為討論不同HCV 基因分型與HCV 載量、肝功能、凝血及自身抗體之間的關(guān)系，本文對114 例HCV 基因型分布及相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年7月—2018年4月安徽省立醫(yī)院感染病院接診的慢性丙型肝炎患者114 例。其中，男性53 例，女性61 例；平均年齡51.8 歲。入選患者均符合我國2015年版《丙型肝炎防治指南》[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過相關(guān)檢測，排除其他血液病及肝炎重疊感染病例。

1.2 儀器與試劑

美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI-7300 基因擴(kuò)增儀，廈門安普利生物工程有限公司9800 全自動醫(yī)用PCR系統(tǒng)及全自動核酸提取工作站，日本日立公司7180生化分析儀，北京賽科希德科技股份有限公司SF-8100 血凝儀、邁瑞醫(yī)療國際有限公司BC-6900 全自動血球儀，江蘇浩歐博生物醫(yī)藥股份有限公司全自動化學(xué)發(fā)光納米磁微粒自身抗體檢測儀。丙型肝炎分型核酸提取試劑及基因分型檢測試劑盒由泰普生物科學(xué)（中國）有限公司提供，其余試劑均選用原廠配套試劑。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣本準(zhǔn)備 收集患者空腹靜脈血4 份，每份5ml。其中2 份血樣置于促凝管中，經(jīng)4000r/min 離心10min，取上層血清分別用于HCV-RNA 含量、HCV 基因型檢測、肝功能指標(biāo)檢測以及自身抗體檢測；另外1 份血樣置于枸櫞酸鈉抗凝管中，經(jīng)3000r/min 離心8min，取上層血漿用于凝血酶原時間（PT）、凝血酶 原活動度（PTA）檢測；最后1 份血樣置于EDTA 抗凝管中，混勻后用于血細(xì)胞計數(shù)測定。

1.3.2 HCV 基因分型檢測 HCV-RNA 提取采用硅膠膜過柱純化技術(shù)，從血清樣本中提取病毒RNA，提取后的RNA 運用一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）技術(shù)和Taqman 探針技術(shù)，實時檢測熒光信號，可判斷樣本為HCV 1b、2a、3a、3b 和6a 亞型單獨感染或混合感染，試劑盒檢測下限為1000copy/ml。

1.3.3 HCV-RNA 定量檢測 HCV-RNA 提取采用安普利全自動核酸提取工作站及配套試劑，提取后的RNA，利用安普利9800 全自動醫(yī)用PCR 系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。線性范圍為1×102～5×107copy/ml；定量結(jié)果超過線性范圍（＞5×107copy/ml）以5×107copy/ml計算。

1.3.4 相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)檢測 肝功能檢測：谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）；凝血功能檢測：PT、PTA、血小板（PLT）；自身抗體檢測：抗核抗體（ANA）、抗U1 小核糖核蛋白抗體（抗RNP）、抗狼瘡細(xì)胞抗體（抗Sm）、抗52 kD 的多肽條段（抗Ro-52）、著絲粒蛋白B 抗體（抗CENP B）、M2 型線粒體抗體（AMA-M2）、抗肝/腎微粒體1 型抗體（LKM1）均按廠家說明書進(jìn)行操作，上機(jī)檢測，質(zhì)控均在控。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較用秩和檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCV 基因分布情況

對114例丙型肝炎患者HCV進(jìn)行基因分型。其中，1b 型92 例，占80.70%；2a 型8 例，占7.01%；6a 型2 例，占1.75%；2a+6a 型5 例，占4.39%；3a+3b 型6例，占5.26%；未分型1 例，占0.88%（見圖1）。單基因型102 例，非單基因型11 例，未分型1 例。

2.2 HCV 基因分型與HCV-RNA 病毒載量的比較

單基因型組與非單基因型組HCV-RNA 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=0.343，P=0.732）。見表1。

2.3 HCV 單基因型感染患者與非單基因型感染患者相關(guān)肝功能指標(biāo)的比較

HCV 單基因型感染患者與非單基因型感染患者ALT 結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），非單基因型組比單基因型感染患者高。而兩者AST 與GGT比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 HCV 單基因型感染患者與非單基因型感染患者相關(guān)凝血指標(biāo)的比較

單基因型感染患者與非單基因型感染患者PLT、PT、PTA 結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 HCV 基因分布圖

表1 不同基因型HCV 病毒載量的比較 [copy/ml，M（P25，P75）]

表2 單基因型感染與非單基因型感染患者的相關(guān)肝功能指標(biāo)的比較 [IU/L，M（P25，P75）]

表3 單基因型感染與非單基因型感染患者的相關(guān)凝血指標(biāo)的比較 M（P25，P75）

2.5 HCV 單基因型與非單基因型感染患者自身免疫抗體的比較

只要有一個自身抗體指標(biāo)為陽性的患者，就將其定義為陽性。結(jié)果顯示：單基因組陽性率4.9%（5/102）與非單基因組陽性率36.4%（4/11）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.408，P=0.000）。

另外，對114 例樣本進(jìn)行自身免疫抗體分析后發(fā)現(xiàn)，單基因型組以抗R0-52 為主，占陽性率的25%，非單基因型組以抗CENPB 為主，占陽性率的40%。

3 討論

全球范圍內(nèi)，HCV 的感染率為3.8%。我國HCV的感染率約為3.2%[7]。由于HCV基因具有高度變異性，不同基因型其治療方案、療效、療程和預(yù)后相差很大，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，1b 亞型患者中進(jìn)展為肝硬化和肝癌的比例高于其他基因型[8]，并且對干擾素的反應(yīng)不如2、3 型好，更易發(fā)展為慢性[9]。因此，HCV 基因分型檢測意義重大。

在我國HCV 基因型分布呈多樣化特征，其中1b較為常見，2a 次之[10]，這與本研究結(jié)果相似。可能與地域分布及感染途徑有關(guān)，SILBERSTEIN[11]研究發(fā)現(xiàn)1b 通過輸血傳播，在全球范圍的感染率很高，70%以上為HCV 感染患者；2a 和2b 占全球感染患者的10%～30%，主要分布在北美、歐洲和日本；1a 基因型與靜脈注射毒品有關(guān)，主要分布在美國和歐洲。另外，本研究的114 例慢性丙型肝炎患者中，發(fā)現(xiàn)11 例非單基因型感染、102 例單基因型感染和1 例未分型。單基因型與非單基因型患者血清中HCV-RNA 濃度無差異，這與SCHIJMAN 等[12]研究一致。表明HCVRNA 濃度高低與是否被HCV 單基因型還是非單基因型感染無關(guān)。

肝功能是反映肝臟損害的最靈敏的指標(biāo)之一。其中ALT、AST、GGT 是應(yīng)用最多的肝臟代謝酶，其水平越高，肝臟組織損傷程度也就越嚴(yán)重。本研究通過對單基因型和非單基因型患者血清的ALT、AST、GGT 水平比較，發(fā)現(xiàn)HCV 非單基因型患者ALT 要高于單基因型，而AST、GGT 水平無差異，這可能是由于ALT 存在于胞質(zhì)內(nèi)，在肝細(xì)胞受到破壞后更易進(jìn)入血循環(huán)中而被檢測到。AST 位于線粒體內(nèi)，需要進(jìn)一步的破壞才會釋放入血。而GGT，當(dāng)肝細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜通透性增加，GGT 釋放出來，但是其敏感性依然不及ALT[13]。

肝臟是產(chǎn)生凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ和X Ⅲ的場所。當(dāng)肝臟受損，會造成這些凝血因子減少；同時HCV 刺激機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生的免疫復(fù)合物會直接或間接損害造血干細(xì)胞，也會造成血小板計數(shù)偏低[14]，從而影響機(jī)體凝血功能。本研究顯示，HCV 單基因型和非單基因型之間，凝血功能無差異，表明HCV基因分型與肝臟凝血功能無關(guān)。有研究指出，這可能與丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[15]。

相關(guān)文獻(xiàn)報道，病毒性肝炎患者血清中存在多種自身抗體，其中又以乙型肝炎、丙型肝炎多見，自身抗體中則以ANA 為主。對病毒性肝炎患者進(jìn)行自身抗體檢測有助于了解患者機(jī)體免疫狀況，以便指導(dǎo)臨床用藥[16]。楊建軍等[17]指出，Ib 型患者自身抗體陽性率高于其他型。同時國外研究學(xué)者KIRDAR 等[18]報道，Ⅰ型HCV 與自身免疫相關(guān)，Ⅰ型HCV 感染者ANA、ASMA、AMA 和LKM 分別占50.0%、16.7%、25.0%和8.3%，Ⅱ型感染者除ANA 外，均未檢測到ASMA、AMA 和LKM。Ⅲ、Ⅳ型未檢測到自身抗體。本研究發(fā)現(xiàn)HCV 非單基因型自身免疫抗體的檢出率要高于單基因型?？赡苁怯捎谧陨砻庖呤荋CV 損傷機(jī)體的一個重要方面[19]，HCV 感染會引發(fā)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生[20]。而非單基因型病毒感染，更容易產(chǎn)生自身免疫抗體，給機(jī)體造成更強(qiáng)的免疫應(yīng)答機(jī)制。同時本研究發(fā)現(xiàn)，單基因型以R0-52 為主，非單基因型以CENPB 為主。究其原因，還有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，丙型肝炎分型對丙型肝炎的治療，以及判斷預(yù)后具有重要的意義。本地區(qū)以單基因型Ⅰb為主，但是非單基因型對肝臟的損傷及引起的自身免疫應(yīng)答，應(yīng)給予足夠的重視。