盧家潮，壽記新，王冰冰，高海東

（鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，河南 鄭州 450052）

腦膠質(zhì)瘤又稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤，其發(fā)病率在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中居首位，且其惡性程度也高于其他顱內(nèi)腫瘤，治療時(shí)間長(zhǎng)、過程非常復(fù)雜、預(yù)后差，對(duì)人類生命健康造成巨大危害[1]。水通道蛋白1（Aquaporin-1, AQP1）作為一種鑲嵌在細(xì)胞膜又極其保守的蛋白，具有自身的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，轉(zhuǎn)運(yùn)分子大小為28 kD，基因定位于人染色體7p14[2]。AQP1 主要定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦室脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞，發(fā)揮維持水通道及離子通道（c-GMP）平衡的雙重效應(yīng)，與腦脊液生成、分泌有關(guān)[3]。研究表明[4-5]，AQP1 在間變性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和腫瘤供血血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，AQP1 mRNA 及蛋白表達(dá)隨腫瘤惡性程度增加而升高。腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1（TRAP1）也稱HSP75，是線粒體熱休克蛋白90（HSP90）的主要成員。穩(wěn)定的TRAP1 蛋白由645 個(gè)氨基酸脫水縮合而成，并且擁有1 個(gè)三磷酸腺苷匹配區(qū)域，在該區(qū)域三磷酸腺苷以獨(dú)特的構(gòu)象與γ 磷酸基團(tuán)進(jìn)行匹配，從而發(fā)揮作用[6]。在膠質(zhì)瘤，線粒體作為腫瘤細(xì)胞的能量代謝中心，TRAP1 的高表達(dá)能改變線粒體的某些融合/ 分裂相關(guān)蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞處于高能量代謝狀態(tài)[7-8]。國外學(xué)者研究分析發(fā)現(xiàn)TRAP1 的表達(dá)與腫瘤直徑的大小、惡性程度的高低及有無轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，即腫瘤直徑越大、惡性程度越高伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者TRAP1 處于高表達(dá)狀態(tài)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)TRAP1 過度表達(dá)增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者死亡風(fēng)險(xiǎn)[9]。但AQP1 與TRAP1 在腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)水平及其相關(guān)性的研究，目前鮮有報(bào)道，本文旨在研究?jī)烧咴谀X膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其相關(guān)性，為實(shí)驗(yàn)及臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年3月—2017年12月在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科病區(qū)的住院患者66 例，根據(jù)術(shù)前患者臨床表現(xiàn)及影像學(xué)資料，術(shù)后病理切片確診為腦膠質(zhì)瘤。全部標(biāo)本均為第1 次手術(shù)切除，且術(shù)前從未進(jìn)行過任何放化療及免疫療法等治療。其中，男性38 例，女性28 例；年齡21～65 歲，平均53.7 歲；根據(jù)《WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤組織學(xué)分類》（2007），將66 例患者分為低級(jí)別組（Ⅰ、Ⅱ級(jí)）（A 組）35 例和高級(jí)別組（Ⅲ、Ⅳ級(jí)）（B 組）31 例。另采集同期15 例行第三腦室底造瘺術(shù)及大腦內(nèi)減壓術(shù)患者的正常腦組織作為對(duì)照組。所有獲取的標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)前由家屬簽署知情同意書并得到本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

AQP1、TRAP1 抗人單克隆抗體均購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，SP 試劑盒、DAB 顯色劑均購自上海哈靈生物科技有限公司，總RNA 提取試劑購自上海富衡生物科技有限公司。RNA 純度經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280 在1.6～1.8 之間，滿足實(shí)驗(yàn)要求。AQP1、TRAP1、β-actin 基因引物序列由Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列：AQP1 正向5'-CGGATCCATGGCCAGCGAGTTCAAGAAG-3'，反向5'-GCTCTAGATTTGGGCTTCATCTCCACCCTG- 3'；TRAP1 正向5'-TTAGTAACATATGGCGCGCGAGCT GCGG-3'，反向5'-TTCCTCGAGTTAGTGTCGCTCCAGG GCCTT-3'；β-actin 正向5'-CGAGCTGGACATCCG CAAAT-3'，反向5'-GTGGCAGGTGGACAGCGAGC-3。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)AQP-1 與TRAP1 mRNA 的表達(dá)

cDNA 4μl，dNTP Mixture（2mmol/L）20μl，引物（10 μmol/L） 各2μl，10×Taq Buffer 5μl，Taq 酶1.5μl，dH2O 30.5μl，總?cè)萘?5μl。AQP1：95℃預(yù)變性3min，92℃變性35 s，57.5℃退火30s，70℃延伸4min，共35 個(gè)循環(huán)，70℃最后延伸14min。TRAP1 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，95℃變性40s，56.8℃退火33s，72℃延伸8min，共35 個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸12min。將RT-PCR 反應(yīng)產(chǎn)物與1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓穩(wěn)定在85V 電泳約52min，接著對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行拍照保存，再經(jīng)美國Eagle EYE Ⅱ型凝膠圖像軟件處理系統(tǒng)，用（目的基因的吸光度值）/（β-actin 吸光度值）代表目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。

1.4 Western blotting 檢測(cè)AQP-1 與TRAP1 蛋白的表達(dá)

提取少量組織標(biāo)本盡量碾碎后放進(jìn)預(yù)冷的含1% PMSF 的RIPA 裂解液，按每孔約80μl 加入6 孔板，放置冰上50min 后吸取裂解液，溫度4℃下將裂解液以14000r/min 離心35min 后取上清液，BCA 蛋白檢測(cè)方法進(jìn)行蛋白定量。AQP1、TRAP1 分別于10%及7% SDS-PAGE 分離，采用半干濕法轉(zhuǎn)至PVDF，常溫下用8%的脫脂牛奶隔離1h，分別加入一抗：小鼠抗人AQP1、TRAP1 抗體（Abcam 公司），工作濃度均為1：1000。二抗：HRP 結(jié)合的抗小鼠IgG 抗體（Zymed Laboratories Inc, 美國），工作濃度1：2000。ECL 化學(xué) 發(fā)光轉(zhuǎn)至X 射線膠片。采用美國Eagle EYE Ⅱ型凝膠圖像軟件處理系統(tǒng)測(cè)定目標(biāo)蛋白和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的吸光度，并以（目標(biāo)蛋白吸光度值）/（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照吸光度值）作為目標(biāo)蛋白半定量相對(duì)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組AQP1 mRNA 及蛋白的表達(dá)情況

3 組AQP1 mRNA 及蛋白表達(dá)的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，A 組、B 組AQP1 mRNA 和蛋白表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)（P＜0.05），B 組AQP1 mRNA 和蛋白表達(dá)較A 組上調(diào)（P＜0.05）。見表1和圖1、2。

2.2 3 組TRAP1 mRNA 及蛋白的表達(dá)情況

3 組TRAP1 mRNA 及蛋白表達(dá)的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，A組、B組TRAP1 mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)（P＜0.05），B 組TRAP1 mRNA 和蛋白表達(dá)較A 組上調(diào)（P＜0.05）。見表2和圖3、4。

表1 各組AQP1 mRNA 及蛋白表達(dá)的比較 （±s）

表1 各組AQP1 mRNA 及蛋白表達(dá)的比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與A 組比較，P ＜0.05。

組別 n AQP1 mRNA AQP1 蛋白對(duì)照組 15 0.336±0.016 0.221±0.011 A 組 35 0.456±0.019① 0.460±0.022①B 組 31 0.783±0.021①② 0.799±0.020①②F 值 11.356 10.298 P 值 0.000 0.000

圖1 AQP1 mRNA 表達(dá)

圖2 AQP1 蛋白表達(dá)

2.3 AQP1 與TRAP1 表達(dá)的相關(guān)性

隨著AQP1 mRNA 及蛋白表達(dá)的增多，TRAP1表達(dá)也有逐漸增多的傾向，Spearman 相關(guān)分析顯示AQP1 mRNA 及蛋白表達(dá)和TRAP1 mRNA 及蛋白表達(dá)無相關(guān)性（rs=0.074 和0.058，P=0.065 和0.080）。

表2 3 組TRAP1 mRNA 及蛋白表達(dá)的比較 （±s）

表2 3 組TRAP1 mRNA 及蛋白表達(dá)的比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與A 組比較，P ＜0.05。

組別 n TRAP1 mRNA TRAP1 蛋白對(duì)照組 15 0.175±0.021 0.204±0.049 A 組 35 0.464±0.039① 0.457±0.023①B 組 31 0.839±0.029①② 0.770±0.035①②F 值 7.255 7.707 P 值 0.000 0.000

圖3 TRAP1 mRNA 表達(dá)

圖4 TRAP1 蛋白表達(dá)

3 討論

目前，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤之所以難根治，根本原因是該類腫瘤擁有非常豐富的血供及具有高度侵襲的特性[10]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，AQP1 mRNA及蛋白表達(dá)主要在側(cè)腦室及第四腦室脈絡(luò)組織上，已 有學(xué)者研究證實(shí)，AQP1 mRNA 及蛋白表達(dá)與Na+-K+-ATP 酶定位一致，集中在于朝向腦脊液的頂質(zhì)膜的 微絨毛的表面，據(jù)推測(cè)，這可能與腦脊液生成和分泌有關(guān)，并參與水和離子平衡調(diào)節(jié)[11]，本研究發(fā)現(xiàn)，AQP1在原發(fā)膠質(zhì)瘤（低度惡性與高度惡性）中普遍表達(dá)，而惡性程度不同的膠質(zhì)瘤AQP1 表達(dá)的特點(diǎn)不同，腫瘤內(nèi)部AQP1 的表達(dá)高于瘤周組織或者正常組織，說明AQP1 的表達(dá)與原發(fā)膠質(zhì)瘤的腫瘤特性有關(guān)，這與EL HINDY 等[12]在AQP1 與人類星形細(xì)胞瘤血管生成的相關(guān)性標(biāo)本中觀察到的結(jié)果類似。而AQP1 在膠質(zhì)瘤新生血管中的普遍表達(dá)則提示AQP1 的作用可能與膠質(zhì)瘤的異常增殖和侵襲性生長(zhǎng)有內(nèi)在聯(lián)系。有文章報(bào)道[13]，TRAP1 在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)控中具有雙重作用，在抑制TRAP1 活性而激活細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，即有大量的能量來源時(shí)可能會(huì)降低細(xì)胞的最大遷移潛能，靶向TRAP1治療可以選擇性地增強(qiáng)抗轉(zhuǎn)移治療的療效。WU 等[14]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織TRAP1 表達(dá)水平高于正常腦組織，使用藥物干擾TRAP1 轉(zhuǎn)錄與翻譯過程，可誘導(dǎo)細(xì)胞核分裂期（G2/M 期）阻滯，導(dǎo)致PKB 磷酸化活性降低，誘導(dǎo)有絲分裂失敗，降低腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A、B 組較對(duì)照組AQP1、TRAP1 mRNA 及蛋白表達(dá)強(qiáng)度上調(diào)，說明AQP1、TRAP1 與膠質(zhì)瘤的發(fā)生與病理等均有密切關(guān)系；且AQP1 與TRAP1 的mRNA 和蛋白表達(dá)強(qiáng)度與膠質(zhì)瘤的腫瘤分期具有一致性，即隨著腫瘤病理級(jí)別增加，AQP1、TRAP1 表達(dá)強(qiáng)度依次增強(qiáng)。但經(jīng)Spearman相關(guān)分析后顯示AQP1 mRNA 及蛋白表達(dá)與TRAP1 mRNA 及蛋白表達(dá)無相關(guān)性。

綜上所述，AQP1、TRAP1 與人腦膠質(zhì)瘤發(fā)病和進(jìn)展關(guān)系密切，而兩者對(duì)膠質(zhì)瘤的病理進(jìn)展無協(xié)同作用。雖然該研究為深入研究膠質(zhì)瘤的分子發(fā)病機(jī)制積累一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但要更深層次地認(rèn)識(shí)膠質(zhì)瘤仍需大樣本對(duì)比分析。