紀(jì)龍，王小卉，劉雪貞，劉華民，張倩倩，楊偉麗，韓東洋，李棟

[山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東 泰安 271000]

先天性心血管?。╟ongenital heart diseases, CHDs）是人類發(fā)病率最高的出生缺陷，研究表明活產(chǎn)兒先天性心血管病平均發(fā)病率為9.1‰，其中亞洲國(guó)家最高，為9.3‰[1]。中國(guó)出生缺陷監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，2000～2011年CHDs 是我國(guó)高發(fā)的畸形之一，并呈逐年上升趨勢(shì)。如何提高CHDs 的早期診斷準(zhǔn)確率，已成為臨床診斷和防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題。目前包括CHDs 在內(nèi)的出生缺陷的早期診斷，臨床上主要依靠妊娠期的影像學(xué)檢查，該診斷方法特異性較差。正是由于缺乏針對(duì)CHDs 特異性較高并且較為簡(jiǎn)易的早期檢測(cè)手段，CHDs 患兒較難被早期發(fā)現(xiàn)，因此，需尋找一種新的高敏感性和高特異性的分子標(biāo)志物，用于CHDs 的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)，進(jìn)而指導(dǎo)疾病預(yù)防，這對(duì)降低CHDs 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

MicroRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)約22 個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA。CHEN 等[2]發(fā)現(xiàn)人類血漿中存在大量miRNA，并進(jìn)一歩證明在RNA 酶、酸堿性、高低溫度等條件改變和長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存均不會(huì)對(duì)血漿中miRNA 的含量造成影響，并且易于在外周血中檢測(cè)，可以便利地運(yùn)用于臨床疾病的診斷，具有臨床診斷標(biāo)志物的重要特質(zhì)。目前血漿miRNA 作為多種疾病尤其是腫瘤分子診斷標(biāo)志物的研究已經(jīng)廣泛開展[3-4]。雖然miRNA 在CHDs 發(fā)病過程中的作用尚不十分明確，但近年來已有研究提示miRNA 與心臟的形成、發(fā)育有關(guān)，可能在CHDs 的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[5]。有關(guān)CHDs 患者外周血miRNA 的研究甚少，最近的一項(xiàng)關(guān)于室間隔缺損（ventricular septal defect, VSD）合并重度肺動(dòng)脈高壓的小樣本研究發(fā)現(xiàn)，通過檢測(cè)對(duì)比VSD 合并PAH 患者血漿的86 種miRNA，得出miR-98、miR-19a-3p、let-7f-5p、miR-198 等的表達(dá)水平升高，而miR-4312、miR-3943、miR-4284 的表達(dá)水平降低[6]。然而miRNA 在CHDs 發(fā)生、發(fā)展過程中究竟扮演何種角色，究竟有多少miRNA 在發(fā)病過程中發(fā)生改變，目前仍不清楚。

因此，本研究首先通過miRNA 表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)VSD 中特定表達(dá)的miRNA 進(jìn)行篩選、鑒定和驗(yàn)證，尋找VSD 分子診斷標(biāo)志物，為進(jìn)一步探討miRNA的異常表達(dá)與CHDs 的關(guān)系提供依據(jù)，進(jìn)而評(píng)估血漿miRNA 作為新的分子標(biāo)志物用于臨床VSD 篩查診斷的價(jià)值和應(yīng)用前景，建立VSD 早期臨床診斷模型，對(duì)現(xiàn)有CHDs 早期診斷方法進(jìn)行有效補(bǔ)充，進(jìn)一步提高CHDs 的診斷效率，改善患者預(yù)后，減輕疾病負(fù)擔(dān)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2012年6月—2015年11月分別在濟(jì)南市兒童醫(yī)院、泰安市婦幼保健院心血管外科就診和治療的4 個(gè)月～6 歲單純性VSD 患者作為VSD 組（85 例）；選取同期于上述醫(yī)院體檢中心健康體檢兒童作為對(duì)照組（80 例），無CHD 家族遺傳史并且與VSD 組來自相同地區(qū)。

本研究選取的對(duì)象通過3 個(gè)階段的對(duì)照性實(shí)驗(yàn)篩選、鑒定血漿有差異的miRNA，并建立VSD 血漿miRNA 早期診斷模型。初始篩選階段，按照1：1匹配收集VSD 組和對(duì)照組研究對(duì)象各3 例，采用miR CURYTMLNA Array（v.18.0）（Exiqon, Vedbaek, Denmark）全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)進(jìn)行差異miRNA表達(dá)譜檢測(cè)，初步篩查VSD 血漿差異miRNA；驗(yàn)證階段擴(kuò)大樣本量，選取表達(dá)量差異（上調(diào)或下調(diào)）1.5 倍以上的8 種 重要的miRNA，在20 例VSD 組和15 例對(duì)照組血漿中采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證芯片的檢測(cè)結(jié)果；在VSD 診斷模型的建立階段，選取新的獨(dú)立組（62 例VSD 組VS 62 例對(duì)照組）樣本再次對(duì)上述已驗(yàn)證的差異血清miRNA 進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，分析其表達(dá)水平與VSD 的相關(guān)性，建立VSD 早期診斷模型，進(jìn)一步探討血漿miRNA 在VSD 臨床診斷中的價(jià)值。

本研究經(jīng)相關(guān)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象由監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書，血液標(biāo)本僅用于本研究實(shí)驗(yàn)。

1.2 血漿標(biāo)本采集和保存

采集病例組和對(duì)照組研究對(duì)象空腹靜脈血標(biāo)本4 ml，2 ml 全血靜置10 min，4 000 r/min 離心10 min，上層透明淡黃色液體即為血漿，收集后分裝入無RNase 的EP 管中，置入-80℃冰箱冷凍備用。另外2 ml 用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，于-20℃冰箱冷凍保存，用于基因組DNA 提取。

1.3 血漿RNA 提取

應(yīng)用Trizol and miRNeasy mini kit（美國(guó)Qiagen 公司）試劑盒提取血漿總RNA，具體操作參見試劑盒說明書。瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA 質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 在260 nm 和280 nm 處的光密度（OD）值（A260/A280）衡量RNA 的純度，OD 值在1.8～ 2.1，認(rèn)為質(zhì)量合格。

1.4 血漿miRNA 芯片檢測(cè)

將提取的血漿總RNA 送上?？党躺锛夹g(shù)服務(wù)公司進(jìn)行miRNA 芯片檢測(cè)。

1.5 qRT-PCR 檢測(cè)miRNA

Rever Tra Ace qPCR-RT Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miscrip SYBR Green PCR Kit 定量試劑盒購(gòu)自上海Toyobo 公司。U6 內(nèi)參引物，let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-379-5p、miR-409-3p、miR-433、miR-487b 和miR-498 引物購(gòu)自上海Gene Pharma 公司。10 μl 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括Nuclease free water 2 μl，5×RT Buffer 2 μl，miRNA ＆ U6 RT Primer mix 0.5 μl，RT Enzyme Mix 0.5 μl，總RNA 5 μl。反應(yīng)進(jìn)行條件：25℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。qRT-PCR 采 用20 μl 體系，包括SYBR 10 μl，miRNA/U6 specific Primer set 1 μl，滅菌水7 μl，cDNA 2 μl。qRT-PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，1 個(gè)循環(huán)；95℃變性12 s，40 個(gè)循環(huán)；62℃退火40 s，熒光信號(hào)采集。miRNA 的表達(dá)水平采用2-△△Ct值表示，△△Ct=VSD 組（Ct 樣本-Ct 對(duì)照）-對(duì)照組（Ct 樣本-Ct 對(duì)照）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)單個(gè)miRNA 和多指標(biāo)聯(lián)合診斷模型進(jìn)行診斷價(jià)值評(píng)價(jià)，首先建立ROC 曲線，通過曲線下面積（AUC）、敏感性、特異性、約登指數(shù)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值等來判斷診斷VSD的效果；利用逐步Logistic 回歸模型建立多指標(biāo)的診斷模型，用以區(qū)分CHDs 患者和對(duì)照人群。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般特征

上述3 階段研究對(duì)象，在年齡、性別等方面均具有可比性，所選研究對(duì)象均為漢族，具體臨床資料見表1～3。

2.2 血漿miRNA 表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果

利用miRNA 芯片技術(shù)檢測(cè)3 例VSD 組和3 例對(duì)照組血漿中的miRNA 表達(dá)特征，初步確定VSD 差異miRNA 表達(dá)譜。微陣列芯片雜交結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，有36 個(gè)表達(dá)有差異的miRNA（差異倍數(shù)＞1.5 或差異倍數(shù)＜0.67，P＜0.05），其中21 個(gè)miRNA 在VSD 組表達(dá)下調(diào)，表達(dá)上調(diào)的miRNA 有15 個(gè)。見表4。

表1 初篩階段VSD 組與對(duì)照組臨床資料比較 （n =3）

表2 qRT-PCR 驗(yàn)證階段VSD 組與對(duì)照組臨床資料比較

表3 診斷價(jià)值評(píng)價(jià)階段VSD 組與對(duì)照組臨床資料 （n=62）

2.3 差異表達(dá)的miRNA 的檢測(cè)結(jié)果

通過查閱文獻(xiàn)，結(jié)合微陣列芯片表達(dá)情況，選擇8 個(gè)差異表達(dá)的let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-379-5p、miR-409-3p、miR-433-3p、miR-487b-5p 和miR-498 運(yùn) 用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行隨后的兩階段大樣本qRT-PCR 驗(yàn)證，檢測(cè)到5 種血漿miRNA（let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433-3p 和miR-487b-5p）在VSD 中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可以選擇作為具有VSD 早期診斷意義的生物標(biāo)志物。見表5。

2.4 單個(gè)VSD 血漿miRNA 的診斷價(jià)值

采用ROC 曲線分析5 種血漿miRNA 對(duì)VSD 的診斷價(jià)值，5 種血漿miRNA（let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433-3p 和miR-487b-5p）的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.767（95% CI：0.683，0.838，P=0.000）、0.709（95% CI：0.620，0.787，P=0.000）、0.832（95% CI：0.754，0.893，P=0.000）、0.678（95% CI：0.588，0.759，P=0.001）和0.698（95% CI：0.609，0.777，P=0.000）；當(dāng)5 種血漿miRNA 表達(dá)量（2-△△Ct）的截?cái)嘀捣謩e取1.05、0.79、0.62、1.10 和1.11 時(shí)，敏感性分別為91.9%、71.0%、74.2%、95.2%和82.3%，特異性分別為53.2%、72.6%、88.7%、33.9%和51.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6和圖1。

2.5 miRNA 診斷模型的建立

利用逐步Logistic 回歸分析模型，以是否患VSD為因變量，5 種miRNA 相對(duì)表達(dá)量為自變量，分析血漿miRNA 的差異表達(dá)是否與VSD 有關(guān)，結(jié)果顯示let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433-3p及miR-487b-5p 的表達(dá)量與VSD 的發(fā)生分別有獨(dú)立的關(guān)聯(lián)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表4 VSD 患者表達(dá)有差異的miRNA

表5 8 種血漿miRNA 的相對(duì)表達(dá)量 （±s）

表5 8 種血漿miRNA 的相對(duì)表達(dá)量 （±s）

miRNA let-7e-5p miR-155-5p miR-222-3p miR-379-5p miR-409-3p miR-433-3p miR-487b-5p miR-498 VSD 組（2-△△Ct） 0.96±0.56 0.89±0.43 0.89±0.21 0.98±0.56 0.88±0.27 0.93±0.24 1.03±0.33 1.03±0.32對(duì)照組（2-△△Ct） 0.49±0.35 0.64±0.27 0.53±0.39 0.89±0.24 0.86±0.31 0.79±0.21 0.80±0.30 1.13±0.41 t 值 5.562 3.951 7.893 1.758 0.274 3.684 4.206 -1.320 P 值 0.000 0.000 0.000 0.081 0.785 0.000 0.000 0.190

聯(lián)合5 種血漿miRNA 指標(biāo)建立多指標(biāo)的診斷模型：Logit（P=VSD）=17.04-[3.34×（let-7e-5p）-2.810×（miR-155-5p）-6.75×（miR-222-3p）-5.56×（miR-433-3p）3.69×（miR-487b-5p）]。診斷模型AUC為0.955（95% CI：0.902，0.984，P=0.000），當(dāng)截?cái)嘀禐?.63 時(shí)，敏感性和特異性分別為83.87%和95.16%，約登指數(shù)為0.79，5 種miRNA 聯(lián)合診斷的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.86%，提示聯(lián)合多個(gè)miRNA 可大幅提高VSD 的診斷效率。見表7和圖2A。

本室進(jìn)一步取AUC＞0.7 的3 種血漿miRNA（let-7e-5p、miR-155-5p 和miR-222-3p）進(jìn)行Logistic 回歸分析（見表8和圖2B），得出診斷模型（見表9）：Logistic（P=VSD）=[7.26-2.68×（let-7e-5p）-2.16×（miR-155-5p）-5.28×（miR-222-3p）]。診斷模型

的AUC 為0.910（95% CI：0.845，0.954，P=0.000），當(dāng)截?cái)嘀禐?.51 時(shí)，敏感性和特異性分別為82.30%和90.30%，約登指數(shù)為0.73，3 種miRNA 聯(lián)合診斷的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為89.47%。進(jìn)一步分析表明：3 個(gè)miRNA 聯(lián) 合（let-7e-5p、miR-155-5p 和miR-222-3p）即可接近于5 個(gè)miRNA 聯(lián)合的診斷效率。

表6 5 種血漿差異表達(dá)miRNA 診斷價(jià)值評(píng)價(jià)相關(guān)指標(biāo)

圖1 5 種血漿miRNA 的ROC 曲線

表7 5 種血漿差異表達(dá)miRNA 的Logistic 回歸分析參數(shù)

表8 3 種血漿差異表達(dá)miRNA 的Logistic 回歸分析參數(shù)

表9 血漿差異表達(dá)miRNA 聯(lián)合診斷模型的價(jià)值評(píng)價(jià)表

圖2 5 種和3 種的血漿miRNA 聯(lián)合ROC 曲線圖

3 討論

在前期研究中，通過miRNA 表達(dá)譜芯片檢測(cè)技術(shù)篩選出VSD 血漿有差異表達(dá)的36 種miRNA。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本對(duì)重要差異miRNA 進(jìn)行兩階段的qRT-PCR檢測(cè)，初步篩選出5 種血漿差異表達(dá)miRNA（miRNA- let-7e、miR-155-5p、miR-222-3p、miRNA-433-3p和miR-487b-5p）作為VSD 早期診斷標(biāo)志物，將其整合后可建立起多指標(biāo)的聯(lián)合診斷模型。

利用ROC 曲線下面積，判斷上述5 個(gè)miRNA 的診斷效能。研究發(fā)現(xiàn)，let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433-3p 和miR-487b-5p 的AUC 值分別為0.767、0.709、0.832、0.678 和0.698，其中miR-222-3p 的診斷效能最高，其他4 個(gè)RNA 的AUC 多集中在0.6～0.8，也具有較好的診斷效能。研究發(fā)現(xiàn)，5種miRNA 的敏感性和特異性分別為91.9%、53.2%；71.0%、72.6% ；74.2%、88.7% ；95.2%、33.9% ；82.3%、51.6%。有些miRNA 分子的敏感性或特異性相對(duì)較低，如let-7e-5p 和miR-487-5p 的特異性在50%左右，而miR-433-3p 的特異性僅為33.9%，即使是診斷效能最高的miR-222-3p，其敏感性及特異性也只能達(dá)到80%左右，單個(gè)miRNA 在臨床上作為理想的分子診斷標(biāo)志物仍有不小的差距。

鑒于此，本研究運(yùn)用逐步Logistic 回歸分析，利用樣品的qRT-PCR 數(shù)據(jù)建立多指標(biāo)的Logistic 回歸分析模型，優(yōu)化組合該差異miRNA，構(gòu)建VSD 聯(lián)合診斷模型。通過聯(lián)合5 種miRNA 診斷模型分析發(fā)現(xiàn)，AUC 達(dá)到0.955，聯(lián)合多個(gè)miRNA 可大幅度提高診斷效能。當(dāng)截?cái)嘀禐?.63 時(shí)，5 種miRNA 聯(lián)合診斷的敏感性和特異性分別為83.87%和95.16%，約登指數(shù)達(dá)到0.79，結(jié)果提示通過構(gòu)建5 種miRNA 診斷模型，可以使診斷的效果更好，真實(shí)性更高。

進(jìn)一步以AUC＞0.7 的3 種miRNA（let-7e-5p、miR-155-5p 和miR-222-3p）構(gòu)建診斷模型，該模型AUC 面積為0.910，截?cái)嘀禐?.51 時(shí)，敏感性和特異性分別為82.30%、90.30%，進(jìn)一步提示多個(gè)miRNA組合可有效提高診斷效能。

let-7 作為一種可能的臨床診斷標(biāo)志物，通常作為一種抑癌物質(zhì)，在腫瘤中表達(dá)下調(diào)，let-7 的正常表達(dá)是可以產(chǎn)生抑制癌癥的作用和效果[7-8]。最新研究發(fā)現(xiàn)，由于let-7 在心血管系統(tǒng)的多種細(xì)胞中，如血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、冠脈平滑肌細(xì)胞等均有表達(dá)，所以let-7 在心血管系統(tǒng)疾病和心臟發(fā)育中的作用十分重要，有研究表明，血漿中l(wèi)et-7b 可能作為急性心肌缺血的生物標(biāo)志物[9]。以上的研究報(bào)告提示let-7 可能在心臟的發(fā)育和心血管疾病的發(fā)生中參與了調(diào)控，但是目前未見有關(guān)let-7e-5p 與先天性心臟病的研究報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)，let-7e-5p 在VSD 組血漿中呈低表達(dá)，下調(diào)到對(duì)照組的27%，ROC曲線分析let-7e-5p 的診斷效能達(dá)到0.767，敏感性為91.9%，提示let-7e-5p 在VSD 的早期診斷中具有一定的臨床意義。

miR-155 在已知的miRNA 中，是與腫瘤關(guān)系最為密切的miRNA[10]。CALIN 等[11]發(fā)現(xiàn)miR-155 可作為一種miRNA 標(biāo)志物，同慢性淋巴細(xì)胞性白血病的預(yù)后和疾病進(jìn)程相關(guān)。另外，KOENIG 等[12]應(yīng)用miRNA 芯片檢測(cè)穩(wěn)定性冠心病患者血漿的miRNA 表達(dá)譜，并進(jìn)一步應(yīng)用定量PCR 檢測(cè)患者血漿中miRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示炎癥相關(guān)的miRNA-155 在內(nèi)皮細(xì)胞中明顯降低，這為穩(wěn)定性冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的臨床診斷提供了潛在的生物標(biāo)志物。目前尚無關(guān)于先天性心血管病與miR-155 表達(dá)的研究報(bào)道。在本研究中，首次發(fā)現(xiàn)miR-155-5p 在VSD 組血漿中表達(dá)下調(diào)。ROC 曲線下面積為0.709，血漿miR-155 診斷VSD 具有較高的敏感性（71.0%）和特異性（72.6%）。血漿miR-155-5p 可以作為VSD 新的無創(chuàng)性診斷標(biāo)志物。

miR-222 與miR-221 具有高度的同源性，基因序列定位于XPII3 大約在1 kb 的區(qū)域內(nèi)。miR-222 在血管生成、再構(gòu)以及腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著重要調(diào)控作用，是目前非常熱門的一個(gè)miRNA 分子。miR-222與心血管系統(tǒng)的研究，大多集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能上，POLISENO 等[13]通過芯片確認(rèn)27 個(gè)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)其中miR-222 能夠抑制靶基因c-kit 的表達(dá)從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成和遷移。雖然未見有關(guān)miR-222 與先天性心血管病的有關(guān)報(bào)道，但是本研究發(fā)現(xiàn)，miR-222 在VSD 組血漿中表達(dá)降低。通過進(jìn)一步繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，miR-222-3p 的曲線下面積最大，達(dá)到0.832，表明這種miRNA 對(duì)VSD 的診斷具有較高的準(zhǔn)確性，值得進(jìn)一步探討其臨床診斷價(jià)值及其與VSD 的致病機(jī)制。

另外，本研究首次報(bào)道m(xù)iR-433-3p 和miR-487b- 5p 在VSD 組血漿中差異表達(dá)，這兩個(gè)miRNA 均未見國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，其在VSD 中的作用尚不清楚。miR-433-3p 和miR-487b-5p 表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組比較均有差異，與VSD 發(fā)病的機(jī)制不清，還有待進(jìn)一步研究。為了解以上所述5 種血漿miRNA 濃度變化是否為VSD 直接導(dǎo)致，在接下來的研究中將選取已經(jīng)手術(shù)治好的室間隔缺損患者，檢測(cè)這5 種血漿miRNA 濃度，并計(jì)算ROC 曲線下面積以及敏感性和特異性，進(jìn)一步驗(yàn)證和明確let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433-3p 和miR-487b-5p 作為輔助診斷VSD 患者生物標(biāo)志物的可行性及價(jià)值。