王靜，趙成誠(chéng)，榮婉

（1.武漢生物工程學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430415；2.武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，湖北 武漢 430212）

結(jié)腸直腸癌（colorectal cancer, CRC）是全世界常見(jiàn)的胃腸腫瘤類型之一。據(jù)估計(jì)，2016年有134 490 例新發(fā)CRC 病例和49 190 例CRC 相關(guān)死亡病例[1]。手術(shù)切除、放化療仍然是目前CRC 治療的主要方式，化療藥物能夠顯著抑制CRC 進(jìn)展[2-3]。但化療藥物的反復(fù)使用，易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，致使化療方案最終失敗。為此，研究CRC 的發(fā)病機(jī)制及新的治療靶點(diǎn)，對(duì)開(kāi)發(fā)新型的CRC 化療藥物，提高CRC 患者的生存率有重要的理論意義。

既往研究發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)與腫瘤轉(zhuǎn)移和治療預(yù)后相關(guān)的11 個(gè)癌癥死亡標(biāo)簽[4-5]，泛素特異性肽酶22（ubiquitin-specifc protease 22, USP22）是其中之一。作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控組蛋白乙?；瘡?fù)合物SAGA 的組成部分，USP22 通過(guò)調(diào)控組蛋白的去泛素化來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮廣泛的生物功能，包括細(xì)胞周期進(jìn)程、胚胎發(fā)育及端粒穩(wěn)態(tài)[6-7]。USP22 在人正常組織中廣泛表達(dá)，但在惡性腫瘤如結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌及肺癌中表達(dá)量上升，與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-10]，這些研究表明USP22 在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用。然而，USP22 對(duì)結(jié)直腸癌具體調(diào)控機(jī)制不詳。本研究采用特異性小干擾RNA（small interference RNA, siRNA）沉默結(jié)直腸癌細(xì)胞中USP22基因的表達(dá)，觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、周期及凋亡的變化，同時(shí)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以期初步闡明USP22 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)影響及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑 HCT-116、SW480、HT-29 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，結(jié)直腸癌組織芯片購(gòu)自于武漢愛(ài)威爾生物科技有限公司，MTT、Annexin V-FITC/PI 試劑盒購(gòu)自于北京碧云天生物技術(shù)研究所，胎牛血清（FBS）、IMDM、L15、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，硝酸纖維素膜、發(fā)光液購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，抗Cyclin B1 抗體、抗p21 抗體、抗CDK2 抗體、抗USP22 抗體、抗GAPDH 抗體、抗p53 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 購(gòu)自武漢博士德生物有限公司，其他常用生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 二氧化碳CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司，電泳儀、電轉(zhuǎn)移購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光檢測(cè)USP22 表達(dá) 組織芯片脫蠟后，高壓抗原修復(fù)20 min；3% H2O2室溫溫育10 min，PBS漂洗，滴加USP22 抗體（1：20），4℃過(guò)夜；PBS 沖洗，Alexa Fluor 594 標(biāo)記山羊抗兔IgG（1：200），37℃孵育1 h，PBS 沖洗，滴一滴抗熒光淬滅封片液（含DAPI），約20 μl；蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 HCT-116、SW480、HC-29分別利用McCOY's 5A、L15、McCOY's 5A 培養(yǎng)基（含10% FBS、100 u/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素）37℃、5% CO2培養(yǎng)。細(xì)胞黏合度達(dá)到90%以上時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS 沖洗，0.25%胰蛋白酶消化，加培養(yǎng)液吹打均勻成單細(xì)胞懸液，按1：2 的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.3 Western blotting 檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中USP22 表達(dá) 棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS 洗2 次，加入RIPA 冰上 裂解20 min，收集細(xì)胞于離心管中，4℃ 12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。將25 μg 提取的蛋白行SDS-PAGE 電泳，半干式電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜后，室溫封閉1 h，兔抗USP22 抗體（1：1 000）4℃孵育過(guò)夜，加羊抗兔二抗（1：10 000）37℃孵育1 h。TBST 洗滌3 次。采用ECL 發(fā)光顯影。并用Quantity One 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.4 Western blotting 檢 測(cè)USP22 siRNA 干擾效率針對(duì)USP22（XM_005256575.2）設(shè)計(jì)特異性的靶序列（USP22 siRNA）5'-GCAGCTCACTATGAAGA AACT-3'；同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照序列（NC）5'-TTCTCC GAACGTGTCACGT-3'。將細(xì)胞分為對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組），NC 組（轉(zhuǎn)染NC 片段）和USP22 siRNA 組（轉(zhuǎn)染USP22 siRNA 片段），利用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染SW480 結(jié)直腸癌細(xì)胞；24 h 后，收集細(xì)胞，RIPA 提取蛋白，通過(guò)Western blotting 檢測(cè)USP22 表達(dá)情況。

1.2.5 細(xì)胞活力檢測(cè) 將SW480 細(xì)胞分為3 組，分組方式同1.2.4，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，傳于96 孔板，37℃、5% CO2分別培養(yǎng)12、24、48、72 及96 h，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。利用MTT 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)每孔光密度（OD）值。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測(cè) 將SW480 細(xì)胞分為3 組，分組方式同1.2.4，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，吸取上清液。PBS 重懸漂洗細(xì)胞，緩慢加入700 μl 預(yù)冷的乙醇，使乙醇終濃度為70%，4℃固定過(guò)夜，1 000 r/min 離心5 min，預(yù)冷PBS 漂洗2 次。加入100 μl RNaseA（50 μg/ml），37℃水浴30 min，加入400 μl PI（50 μg/ml），4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將SW480 細(xì)胞分為3 組，分組方式同1.2.4，分別轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 及PI 染色，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.2.8 Western blotting檢測(cè) 將SW480細(xì)胞分為3組，分組方式同1.2.4，分別轉(zhuǎn)染24 h 后棄上清液，收集細(xì)胞，RIPA 裂解收集蛋白，以Cyclin B1（1：1 000）、p21（1：800）、CDK2（1：1 000）、p53（1：1 000）為一抗，通過(guò)Western blotting 檢測(cè)各指標(biāo)的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織USP22 高表達(dá)

免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中，USP22異常高表達(dá)；配對(duì)的癌旁組織中，USP22 呈陰性。見(jiàn)圖1。

2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞株USP22 表達(dá)情況

圖1 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中USP22 表達(dá) （×200）

Western blotting 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29、SW480、HCT-116 均表達(dá)USP22，HT-29、HCT-116和SW480 細(xì)胞中USP22 相對(duì)表達(dá)量（相對(duì)GAPDH）分別為（0.61±0.03）、（0.73±0.04）和（0.85±0.06）。各組細(xì)胞USP22 表達(dá)有差異（F=69.130，P=0.000）；與HT-29 細(xì)胞、HCT-116 細(xì)胞比較，SW480 細(xì)胞中USP22 表達(dá)量最高（P＜0.05），因此選擇SW480 細(xì)胞作為后續(xù)研究。見(jiàn)圖2。

2.3 USP22 siRNA 降低USP22 的表達(dá)

USP22 siRNA 轉(zhuǎn)染SW480 細(xì)胞，作用24h 后檢測(cè)USP22 的表達(dá)量。對(duì)照組、NC 組及USP22 siRNA 組USP22 相對(duì)表達(dá)量（相對(duì)GAPDH）分別為（0.98± 0.15）、（0.94±0.22）和（0.30±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=200.600，P=0.000）。USP22 siRNA 組與對(duì)照 組比較，USP22 siRNA 可降低USP22 的表達(dá)量（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 USP22 抑制后細(xì)胞增殖能力情況

對(duì)照組、NC 組、USP22 siRNA 組在12、24、48、72 及96h 的OD 值比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的OD 值有差異（F=315.312，P=0.000）；②3 組在相同時(shí)間段的OD 值有差異（F=716.226，P=0.000）；③3 組OD 值變化趨勢(shì)有差異（F=37.270，P=0.000）。見(jiàn)表1。

圖2 3 種細(xì)胞株中USP22 蛋白表達(dá)情況

2.5 USP22 抑制后細(xì)胞周期的變化情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照組、NC 組及USP22 siRNA 組G0/G1期細(xì)胞占比分別為（43.16± 0.64）%、（45.35±0.85）%和（67.94±2.03）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=322.800，P=0.000），USP22 干擾后，G0/G1期細(xì)胞占比較對(duì)照組升高（P＜0.05）；對(duì)照組、NC 組及USP22 siRNA 組S 期細(xì)胞占比分別為（38.54±1.05）%、（37.23±1.90）%和（16.36±0.75）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2628.000，P=0.000），USP22干擾后，S 期細(xì)胞占比較對(duì)照組降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖3 3 組USP22 的表達(dá)情況

2.6 USP22 抑制后細(xì)胞凋亡率的變化情況

細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，對(duì)照組、NC 組和USP22 siRNA 組早期凋亡細(xì)胞率分別為（6.59±0.11）%、（8.73± 0.14）%和（21.18±0.25）%，3 組凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=492.800，P=0.000）。與對(duì)照組比較，USP22 siRNA 增加細(xì)胞早期凋亡率（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

表1 各組細(xì)胞在不同時(shí)間條件下OD 值的變化 （±s）

表1 各組細(xì)胞在不同時(shí)間條件下OD 值的變化 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與12 h 比較，P ＜0.05。

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h對(duì)照組 0.41±0.02 0.67±0.01② 0.79±0.06② 0.95±0.04② 1.24±0.05②NC 組 0.41±0.01 0.63±0.03② 0.74±0.06② 0.84±0.02② 1.07±0.07②USP22 siRNA 組 0.41±0.02 0.43±0.01①② 0.48±0.03①② 0.56±0.06①② 0.65±0.04①②

圖4 USP22 抑制后SW480 細(xì)胞周期的變化情況

2.7 USP22 抑制后周期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

對(duì)照組、NC 組和USP22 siRNA 組中周期蛋白 CyclinB1、CDK2 的表達(dá)有差異（F=377.346 和211.132，P=0.000），USP22 siRNA 組中CyclinB1、CDK2 的表達(dá)量較對(duì)照組降低（P＜0.05）；3 組p21 和p53 的表達(dá)量有差異（F=168.414 和392.018，均P=0.000），USP22 siRNA 組中p21、p53 的表達(dá)量較對(duì)照組升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2和圖6。

圖5 USP22 抑制后SW480 細(xì)胞凋亡率的變化情況

表2 3 組周期相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表2 3 組周期相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 CyclinB1 CDK2 p21 p53對(duì)照組 0.77±0.08 0.86±0.02 0.25±0.01 0.45±0.02 NC 組 0.75±0.08 0.84±0.04 0.26±0.02 0.48±0.03 USP22 siRNA 組 0.30±0.03? 0.43±0.09? 0.62±0.07? 0.91±0.09?F 值 377.346 211.132 168.414 392.018 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖6 USP22 抑制后，周期蛋白表達(dá)

3 討論

2005年，GLINSKY 等[11]對(duì)各種腫瘤組織的mRNA 水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的11 個(gè)過(guò)表達(dá)的基因可以用作癌癥死亡標(biāo)志基因，包括USP22、BUB1、HEC1/KNTC2、CCNB1、Ki67、Gbx2、FGFR2、ANK3、CES、BMI-1和RNF2。USP22 過(guò)表達(dá)可能與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥性相關(guān)。有研究認(rèn)為，利用慢病毒載體sh-USP22 能有效抑制USP22基因的表達(dá)，并有效抑制鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞的裸鼠成瘤能力[12]。張琳等[13]研究認(rèn)為，結(jié)直腸癌組織中USP22 的異常高表達(dá)可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。USP22 表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞系對(duì)吉西他濱敏感性相關(guān)，抑制USP22 表達(dá)增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，可有效逆轉(zhuǎn)吉西他濱的耐藥[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HT-29、HCT-116、SW480 3 株結(jié)直腸癌細(xì)胞中均有USP22 表達(dá)，其中SW480 的表達(dá)量最高。

USP22 在細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中起到重要作用。hSAGA 是轉(zhuǎn)錄輔助因子復(fù)合物，其通過(guò)組氨酸尾部的特異性氨基酸共價(jià)修飾（例如乙?；?、甲基化和去泛素化）將其轉(zhuǎn)錄復(fù)合物募集到其靶基因的啟動(dòng)子以激活基因轉(zhuǎn)錄[15-16]。USP22 是hSAGA 的亞單位，可以引起組蛋白H2A 和H2B 的去泛素化和組蛋白H4 的乙?；痆17]。本研究使用RNAi 的方法探索抑制USP22對(duì)于結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP22 表達(dá)量的減少可以增加G0/G1期的細(xì)胞比例，使結(jié)直腸癌細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，從而抑制細(xì)胞的周期進(jìn)程。此外，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程[18]相關(guān)的CyclinB1、CDK2 蛋白的表達(dá)量也降低，而細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子p21[19]的表達(dá)量升高。p21 的表達(dá)量與細(xì)胞凋亡同樣密切相關(guān)，本研究也發(fā)現(xiàn)USP22 被抑制后可以增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡比例，說(shuō)明USP22 可以影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，USP22 抑制后，能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果可以為篩選USP22 作為治療結(jié)直腸癌的靶標(biāo)提供理論依據(jù)，但具體的作用機(jī)制以及相關(guān)通路需要更進(jìn)一步的研究。