王佳琦 王璐 潘玉光

摘要：根據(jù)甘草懸浮細胞經(jīng)茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)前后的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選到1個響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，通過克隆該基因片段并進行序列分析確定該基因編碼1個甘草MYB轉(zhuǎn)錄因子，將其命名為GlMYB10。該基因開放閱讀框全長為1 172 bp，編碼產(chǎn)物包含340個氨基酸，對其編碼產(chǎn)物的基本理化性質(zhì)、親水性和疏水性、保守結(jié)構(gòu)域等方面進行了生物信息學(xué)分析和預(yù)測，對GlMYB10基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列進行聚類分析。結(jié)果表明，其與木豆中MYB類轉(zhuǎn)錄因子的同源性最高。應(yīng)用qRT-PCR分析該基因的表達水平發(fā)現(xiàn)，GlMYB10基因在甘草懸浮細胞受MJ誘導(dǎo)后的表達量明顯高于未誘導(dǎo)組，并且誘導(dǎo)9 h后表達量最高。通過對GlMYB10基因進行克隆與表達分析，為探索該基因在甘草懸浮細胞黃酮類化合物生物合成中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘草;懸浮細胞;茉莉酸甲酯;MYB轉(zhuǎn)錄因子;基因克隆;基因表達

中圖分類號： S567.7+10.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0067-04

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch），豆科多年生草本植物，主要分布在內(nèi)蒙古、寧夏、新疆、甘肅等西部地區(qū)，具有抗炎、抗病毒、抗癌防癌、保肝解毒、調(diào)節(jié)免疫功能以及降血脂、抗動脈粥樣硬化等心腦血管藥理活性，是應(yīng)用最廣的補益類藥食兼用的大宗藥材[1]。近年來，由于無節(jié)制采挖、過度放牧及不合理工農(nóng)業(yè)占地等，野生甘草資源逐年銳減，栽培品種收獲期過長使得靠大面積人工栽培來滿足市場需求存在諸多困難。植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是目前公認的最有前景的珍貴植物藥物資源的替代生產(chǎn)技術(shù)之一，可以很好地解決天然植物資源匱乏問題。但由于植物細胞遺傳與生理的不穩(wěn)定性及細胞間的不一致性等各種原因，使得甘草懸浮細胞中主要目標產(chǎn)物——黃酮類化合物的含量很低，阻礙了通過細胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)藥用成分的進程。

轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄起始過程中RNA聚合酶所需的輔助因子，可激活特定次生代謝產(chǎn)物系列合成酶的協(xié)同表達，有效地促進目標次生代謝產(chǎn)物的合成。因而利用轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因細胞系成為提高產(chǎn)量的有效途徑之一。MYB類轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)量最多、功能最多樣化的一類轉(zhuǎn)錄因子[2]，許多研究表明MYB轉(zhuǎn)錄因子家族在植物黃酮類化合物合成代謝調(diào)控中發(fā)揮更主要的作用[3]。Moyano等發(fā)現(xiàn)MYB340和MYB305在金魚草花中特異表達，MYB305激活了苯丙烷代謝途徑的第1個酶苯丙氨酸酶（PAL），MYB340激活了Pal基因啟動子的轉(zhuǎn)錄，這2種轉(zhuǎn)錄因子還能激活黃酮代謝途徑中其他兩個基因的表達，因而將植物次生代謝的早期和晚期步驟連接起來[3]。原花青素（proanthocyanidin）[3]、黃酮醇（flavonol）[4-6]、異黃酮（isoflavonoid）[7]等類黃酮的合成均受到MYB類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是植物次生代謝途徑中最主要的信號分子，它常常作為第二信使參與植物次生代謝物尤其是黃酮類化合物的合成調(diào)控[8]。為進一步探明MYB轉(zhuǎn)錄因子在甘草黃酮類化合物合成中的作用，本研究利用甘草懸浮細胞受MeJA誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行分析，得到1條響應(yīng)MeJA脅迫的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因GlMYB10，通過RT-PCR的方法克隆得到該基因，再通過生物信息學(xué)軟件分析該基因的特征，同時利用熒光定量PCR比較甘草細胞懸浮體系中添加MeJA后各時間段GlMYB10基因的表達水平，為深入研究MYB轉(zhuǎn)錄因子基因在甘草黃酮類化合物生物合成途徑上的分子調(diào)控機制提供依據(jù)，對進一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)細胞株具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗于2017年10月在內(nèi)蒙古科技大學(xué)植物細胞培養(yǎng)實驗室進行。供試的甘草品種為烏拉爾甘草，種子購自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市達拉特旗。愈傷組織由幼嫩的甘草無菌苗下胚軸和子葉誘導(dǎo)而來，在附加0.5 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L NAA與0.5 mg/L 6-BA的固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)和繼代。懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)：取6 g分散性強、生長狀態(tài)良好的固體細胞置于250 mL三角瓶中，120 r/min振蕩培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)基為100 mL液體MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，光照度36 μmol/（m2·s），光照時間16 h/d，培養(yǎng)溫度25 ℃[7]。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、pUCm-T載體均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。T4-DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ均購自寶生物工程（大連）有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli）Top 10購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甘草懸浮細胞總RNA的提取及cDNA的合成 將懸浮培養(yǎng)的甘草細胞抽濾后迅速轉(zhuǎn)移至研缽中研磨，同時向研缽不間斷地添加液氮，研磨成細細的粉末即可?？俁NA提取步驟嚴格按照TaKaRa Total RNA提取試劑說明書進行操作。以提取的甘草懸浮細胞總RNA為模板，利用Prime ScriptTM Reverse Transcriptase Kit合成cDNA第1鏈。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中目標基因的ORF序列使用Primer 5.0設(shè)計特異引物：GlMYB10-F，5′-ACCTCCTCCACTACTCTTCATTA-3′;GlMYB10-R，5′-TCATAAAGATCCAAATTGGCA-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 GlMYB10基因的克隆 以cDNA作為模板，利用合成引物進行快速體外擴增。產(chǎn)物用生工生物工程（上海）股份有限公司SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進行純化。純化后的PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體在T4-DNA連接酶作用下于16 ℃過夜酶連，之后轉(zhuǎn)化到Top 10大腸桿菌中，37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。長出單菌落后，畫線培養(yǎng)，菌落PCR驗證。EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切過夜電泳再次驗證目的基因與pUCm-T克隆載體已導(dǎo)入大腸桿菌Top 10。菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。

1.2.4 序列分析 使用序列分析軟件DNAMAN將測序結(jié)果進行拼接，找出GlMYB10開放閱讀框（ORF），并翻譯獲得其編碼的氨基酸序列;在GenBank中下載其他植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列與GlMYB10進行Blast同源性對比，得出不同植物MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列;利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。把甘草GlMYB10蛋白進行分析（http：//web.expasy.org/protparam/），推測蛋白的分子量。利用ProtScale工具（http：//web.expasy.org/protscale/）對甘草GlMYB10蛋白進行親水性/疏水性分析。通過PORTER（http：//distill.ucd.ie/porter/）進行分析，對該蛋白中各個氨基酸殘基對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。將GlMYB10基因編碼的氨基酸序列提交至SWISS-MODEL在線分析軟件，預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

1.2.5 甘草細胞GlMYB10基因在不同MeJA誘導(dǎo)處理時間的表達分析 以甘草懸浮細胞系為研究對象，將生長狀態(tài)良好的種子細胞接種于新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，添加 100 mol/mL MeJA進行誘導(dǎo)，以加入無水乙醇（配制MeJA的溶劑）為對照組，分別在添加后1、3、6、9、12 h取樣，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法同“1.2.1”節(jié)，對GlMYB10基因進行熒光定量PCR，以Actin作為內(nèi)參基因，參照2×SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit（TaKaPa）熒光定量試劑盒說明書進行熒光定量試驗，采用2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草懸浮細胞總RNA的提取

紫外分光光度計測得總RNA的D280 nm/D260 nm、D260 nm/D230 nm均在2.0左右，純度較好，所提RNA濃度均在1 500 ng/μL左右，可用作下一步試驗，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

2.2 甘草MYB轉(zhuǎn)錄因子GlMYB10基因的克隆

反轉(zhuǎn)錄試劑盒一步法將甘草無菌苗總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，測其濃度均在1 800 ng/μL左右，利用設(shè)計合成的引物對其進行20 μL體系快速擴增（圖2）。對PCR產(chǎn)物中 1 000 bp 左右處的條帶進行回收后與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top 10，37 ℃過夜倒置培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，劃線再培養(yǎng)過夜至長出菌落，依次挑取菌落1/3左右按 10 μL 體系進行菌落PCR驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖3可見，大腸桿菌Top 10菌落中的目的基因已被插入，挑取該菌落搖菌提質(zhì)粒，用EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶過夜跑電泳再次驗證，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.3 甘草GlMYB10基因的生物信息學(xué)分析

克隆到的GlMYB10轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列包含1個 1 172 bp 的ORF，共編碼340個氨基酸;用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）對GlMYB10蛋白在線分析，推測其分子量為38.718 14 ku，等電點為8.51。選取甘草GlMYB10蛋白與其他植物中功能已確定的轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列，經(jīng)MEGA 7.0軟件鄰接（neighbour joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖4。根據(jù)圖4中所示分枝的長度，計算出烏拉爾甘草與其他物種親緣關(guān)系，其由近及遠依次為赤豆、甜橙、大豆、木豆、紫苜蓿、狹葉羽扇豆、蓖麻、鷹嘴豆、四季豆。其中，與豆科植物赤豆親緣關(guān)系較近，相比之下，與豆科親緣關(guān)系較遠。

利用ProtScale工具（http：//web.expasy.org/protscale/）對GlMYB10轉(zhuǎn)錄因子蛋白進行親水性/疏水性分析，發(fā)現(xiàn)其親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，所以該蛋白屬于親水蛋白。通過SOPMA對GlMYB10轉(zhuǎn)錄因子蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，該蛋白中α-螺旋為27.73%、β-折疊為0、β-轉(zhuǎn)角為944%、無規(guī)卷曲為40.71%、延伸鏈為22.12%，α-螺旋和無規(guī)卷曲為為主要的結(jié)構(gòu)元件，而β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈則散布于蛋白中。通過SWISS-MODEL對GlMYB10基因所編碼的氨基酸序列在線分析，預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，從圖5看出，該蛋白含有大量的α-螺旋與無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。

2.4 熒光定量PCR表達分析

使用SYBR Green化學(xué)染料，運用的qRT-PCR方法對正常懸浮培養(yǎng)的細胞與添加MeJA誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞分別在添加后不同時間點進行取樣和GlMYB10基因的表達分析，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行分析，即先根據(jù)“ΔCT=CT，目的基因-CT，內(nèi)參基因”計算，再根據(jù)“ΔΔCT=ΔCT，試驗組-ΔCT，對照組”進行計算，最后依據(jù)“相對表達=2-ΔΔCT”計算出相對表達數(shù)值。以處理時間為橫坐標，相對表達量為縱坐標做圖。

由圖6可以看出，在1～12 h期間，GlMYB10基因在添加MeJA誘導(dǎo)后的幾個時間點相對表達量都大于對照組，并且在 9 h 表達量最高，說明轉(zhuǎn)錄因子GlMYB10基因的表達明顯響應(yīng)信號分子MeJA的誘導(dǎo)。

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)錄因子是生物體內(nèi)的一種蛋白因子，它能與結(jié)構(gòu)基因上游特異性DNA序列結(jié)合，并對基因的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用[9-10]。研究表明，在許多功能基因的啟動子中都含有MYB結(jié)合元件（核心序列為TAACTG），在逆境脅迫下，MYB轉(zhuǎn)錄因子與該元件的結(jié)合能夠激活脅迫應(yīng)答基因的表達。另外，MYB基因明顯受環(huán)境因子所誘導(dǎo)，如信號分子脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）等[11-14]，Chen等對125個R2R3-MYB成員的研究結(jié)果表明，約32%成員受JA誘導(dǎo)，約4%下調(diào)[15]。這些初步的結(jié)果表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛地參與了對調(diào)控植物逆境脅迫響應(yīng)有重要作用的激素應(yīng)答過程。MeJA是茉莉?qū)偎剀盎ㄖ邢憔偷挠袣馕痘衔铮谥参镏袕V泛分布，廣泛參與了植物防御信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)與放大過程[12]，引起細胞抗逆反應(yīng)產(chǎn)物的表達，對多種次生代謝產(chǎn)物的合成具有誘導(dǎo)作用，被認為是非常有效的誘導(dǎo)子。MeJA已在多種藥用植物細胞培養(yǎng)中使用，效果顯著[13-15]，如外源的MeJA對于重要的藥用次生代謝產(chǎn)物如紫杉醇、長春堿、東蓑若堿、尼古丁、青蒿素等均有顯著的誘導(dǎo)合成作用[16-17]。

本研究將添加MeJA誘導(dǎo)后表達差異顯著的MYB轉(zhuǎn)錄因子GlMYB10基因克隆出來，該基因具有長度為1 172 bp的完整ORF，編碼340個氨基酸，該蛋白相對分子量為 38.718 14 ku，理論等電點為8.51，親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，屬于親水蛋白。對該基因進行生物信息學(xué)分析，序列比對發(fā)現(xiàn)其屬于典型的MYB基因家族。另外以甘草懸浮細胞為研究對象，在種子細胞接種于新鮮培養(yǎng)基48 h后加入信號分子MeJA誘導(dǎo)，用熒光定量PCR技術(shù)檢測誘導(dǎo)不同時間后GlMYB10基因的表達情況，結(jié)果表明，添加MeJA誘導(dǎo)后明顯提高了GlMYB10基因的表達，且在誘導(dǎo)后9 h表達量最高，MeJA誘導(dǎo)后不同時間段的差異性表達有利于進一步了解轉(zhuǎn)錄因子GlMYB10在甘草細胞懸浮培養(yǎng)過程中調(diào)控黃酮合成的作用。

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